Ein monosynaptischer Erregungsweg im Hirnstamm, der Bewegungsaktivitäten und sympathische Herz-Kreislauf-Reaktionen steuert

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5079 (2022) Diesen Artikel zitieren

3666 Zugriffe

1 Zitate

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Übung, einschließlich Fortbewegung, erfordert entsprechende autonome kardiovaskuläre Anpassungen, um den Stoffwechselanforderungen kontrahierender Muskeln gerecht zu werden. Die funktionelle Gehirnarchitektur, die diesen Anpassungen zugrunde liegt, bleibt jedoch unbekannt. Hier demonstrieren wir Hirnstammschaltkreise, die eine wesentliche Rolle bei der Weiterleitung willkürlicher motorischer Signale, d. h. zentraler Befehle, spielen, um Bewegungsaktivitäten und sympathische Herz-Kreislauf-Reaktionen anzutreiben. Mesenzephale Bewegungsneuronen bei Ratten übertragen zentrale befehlsgesteuerte Erregungssignale zumindest teilweise über glutamaterge Prozesse auf das rostrale ventrolaterale Mark, um sowohl das somatomotorische als auch das sympathische Nervensystem zu aktivieren. Die optogenetische Erregung dieses monosynaptischen Signalwegs löst Bewegungs- und Herz-Kreislauf-Reaktionen aus, wie sie beim Lauftraining zu sehen sind, während die Hemmung des Signalwegs die Bewegungsaktivitäten und den Blutdruckanstieg beim freiwilligen Laufen unterdrückt, ohne die basale kardiovaskuläre Homöostase zu beeinträchtigen. Diese Ergebnisse zeigen einen wichtigen subkortikalen Weg, der zentrale Befehlssignale überträgt, und liefern wichtige Einblicke in den zentralen Schaltkreismechanismus, der für die physiologische Konditionierung erforderlich ist, die für die Maximierung der Trainingsleistung unerlässlich ist.

Übung einschließlich Fortbewegung, die bei Wirbeltieren, einschließlich Menschen, zum grundlegenden Verhalten gehört, wird von autonomen Herz-Kreislauf-Anpassungen begleitet, die die für die Kontraktion der Skelettmuskulatur benötigten Stoffwechselressourcen wie Treibstoff und Sauerstoff bereitstellen und dadurch die körperliche Leistungsfähigkeit steigern. Der Beitrag eines vorwärtsgerichteten absteigenden motorischen Signals vom Vorderhirn zur Herz-Kreislauf-Kontrolle wird seit mehr als einem Jahrhundert vermutet1,2. Derzeit wird dieses Feedforward-Signal als zentraler Befehl bezeichnet und als parallele Aktivierung der somatischen und autonomen motorischen Systeme im Gehirn postuliert, um gleichzeitig die Muskelaktivität zusammen mit dem arteriellen Druck und der Herzkontraktilität zu erhöhen3. Dieses Konzept stammt ursprünglich aus einer Humanstudie, die zeigte, dass das Ausmaß der kardiovaskulären Reaktionen während freiwilliger isometrischer Übungen bei konstanter Muskelspannung positiv mit dem Ausmaß der zentralen Befehlsaktivierung korrelierte, die durch reflexartige Kontraktionen aufgrund von Sehnenvibrationen entweder am Agonisten- oder Antagonistenmuskel verändert wurde4. Der zentrale Befehl ist mit der Aktivierung des sympathischen Nervensystems unabhängig von der Bewegungsrückmeldung gekoppelt, wie sich in der Zunahme kardiovaskulärer Variablen während der fiktiven Fortbewegung bei dekortizierten, gelähmten Katzen5 und in übertriebenen kardiovaskulären Reaktionen auf willkürliche Muskelkontraktionen bei menschlichen Probanden nach einer Lähmung zeigt6,7.

Der genaue Ort der zentralen Befehlsquelle bleibt unklar, da der zentrale Schaltkreismechanismus, durch den zentrale Befehlssignale autonome kardiovaskuläre Anpassungen während des Trainings hervorrufen, noch vollständig aufgeklärt werden muss. Autonome Gehirnregionen, die als Reaktion auf freiwillige körperliche Betätigung aktiviert werden8,9,10,11,12 oder Regionen, deren Stimulation entweder autonome oder somatomotorische Reaktionen hervorruft13,14,15,16,17,18, können an der zentralen Befehlskontrolle des Kreislaufs beteiligt sein. Humanstudien mit neurochirurgischen Techniken legten beispielsweise nahe, dass mesenzephale Schaltkreise, einschließlich des Nucleus subthalamicus (STN) und des periaquäduktalen Graus (PAG), deren neuronale Aktivitäten bei Willensübungen erhöht sind11, subkortikale Schaltkreise so konfigurieren, dass sie zentrale Befehlssignale19 weiterleiten, was durch die Druckwirkung von belegt wird elektrische Stimulation des STN17 oder des dorsalen/lateralen PAG18 bei wachen Patienten mit Parkinson-Krankheit oder chronischen Schmerzen. Dennoch konnten keine kausalen Rollen dieser Gehirnregionen bei autonomen Veränderungen während des Trainings sowie funktionelle Zusammenhänge mit anderen Regionen nachgewiesen werden. Auch das Gehirnsubstrat der zentralen Führung hat klinische Bedeutung erlangt. Eine abnormale kardiovaskuläre Regulation während des Trainings bei pathologischen Zuständen wie Herzinsuffizienz erhöht die Belastungsintoleranz und das Risiko tödlicher Herzereignisse wie Arrhythmien20. Dies ist zumindest teilweise auf eine Funktionsstörung der zentralen Steuerung zurückzuführen21,22, wohingegen therapeutische Übungsprogramme für Patienten ihren Funktionsstatus und ihr Ergebnis verbessern23.

Das rostrale ventrolaterale Mark (RVLM), das sich unmittelbar kaudal des kaudalen Pols des Gesichtskerns befindet, enthält spinal hervorstehende, sympathische prämotorische Neuronen, von denen mehr als die Hälfte adrenerge C1-Neuronen sind24. Sowohl RVLM-C1- als auch Nicht-C1-Neuronen werden durch freiwillige Bewegung angeregt8,9,12 und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des sympathischen vasomotorischen Tonus25,26,27,28. Somit ist der RVLM wahrscheinlich ein Schlüsselknoten des zentralen Schaltkreismechanismus für sympathische Herz-Kreislauf-Reaktionen während des Trainings29. Um in der vorliegenden Studie einen subkortikalen monosynaptischen Weg zu identifizieren, der während freiwilliger körperlicher Betätigung zentrale Befehlssignale an den RVLM überträgt, um kardiovaskuläre Reaktionen hervorzurufen, führten wir funktionelle Neuroanatomie- und in vivo-physiologische Experimente an Ratten durch, um periphere Nervenentladungen, kardiovaskuläre Veränderungen und Verhaltensweisen aufzuzeichnen Kombination mit optogenetischen Techniken zur Manipulation eines interessierenden Signalwegs.

Wir suchten zunächst bei Ratten nach RVLM-projizierenden Neuronen durch retrograde Verfolgung mit dem Tracer, der Choleratoxin-b-Untereinheit (CTb), der einseitig in das RVLM injiziert wurde (Abb. 1a, b). Es wurde festgestellt, dass eine signifikante Anzahl von CTb-markierten neuronalen Zellkörpern bilateral in Mittelhirnbereichen verteilt sind, einschließlich des Nucleus cuneiformis (CnF) und des Nucleus pedunculopontine tegmentalis (PPTg), wobei letzterer viele cholinerge Neuronen beherbergte (Abb. 1c). Diese beiden Kerne bilden einen Funktionsbereich, der als mesenzephale Bewegungsregion (MLR) bekannt ist und in der Lage ist, die Fortbewegung zu initiieren und zu steuern, und der evolutionär bei allen Säugetierarten, einschließlich des Menschen, gut konserviert ist30,31. Daher haben wir uns auf diesen monosynaptischen MLR → RVLM-Weg als Kandidaten für die subkortikale Route konzentriert, die die zentrale Befehlssignalisierung für Bewegungsübungen vermittelt. Das MLR enthält neben den cholinergen PPTg-Neuronen auch glutamaterge und GABAerge Neuronen, die bilateral zahlreiche Projektionen durch die medulläre Formatio reticularis senden32. Allerdings waren nur sehr wenige CTb-markierte PPTg-Neuronen immunreaktiv für Cholinacetyltransferase (ChAT) (0,6 ± 0,3 %, n = 3) (Abb. 1d). Daher sind RVLM-projizierende MLR-Neuronen grundsätzlich nichtcholinerg.

a, b CTb-Injektion in den RVLM einseitig. TH-Tyrosinhydroxylase; IO minderwertiger Olivenkern; LPGi lateraler paragigantozellulärer Kern; NA Nucleus anbiguus. Maßstabsleiste: 1 mm. c Zeichnung der Verteilung von CTb-markierten Zellen [kombiniert aus 8 Ratten (6 Männchen, 2 Weibchen)] und CTb-positiven oder -negativen ChAT-immunreaktiven Zellen [kombiniert aus 3 von 8 Ratten (2 Männchen und 1 Weibchen)] in der koronale Abschnitt des Mittelhirns. Aquädukt; PAG periaquäduktales Grau. d Konfokales Bild, das zeigt, dass CTb-markierte PPTg-Zellen nicht mit ChAT-immunreaktiven Zellen fusioniert wurden. Maßstabsbalken: 50 μm. e, f AAV-CMV-ChIEF-tdTomateninjektionen in den MLR bilateral. Maßstabsbalken: 1 mm (Mittelhirn) und 200 μm (vergrößert). g tdTomatenmarkierte Axone, verteilt im ventralen Mark. Maßstabsleiste: 1 mm. h Konfokales Bild, das enge Assoziationen von tdTomato-markierten axonalen Schwellungen, die VGLUT2 enthalten (Pfeilspitzen), mit dem neuronalen Dendriten RVLM C1 und dem Zellkörper (Sternchen) zeigt. Maßstabsbalken: 10 μm. i Experimentelles Schema zur Untersuchung der Fos-Immunreaktivitäten in RVLM-projizierenden MLR-Neuronen von auf dem Laufband trainierten und nicht trainierten Ratten. j Immunfluoreszenzfärbung von GFP und Fos. Pfeilspitzen zeigen die Fos-Expression in GFP-markierten Zellen im PPTg an. Maßstabsbalken: 100 μm. k Vergleiche von Fos-immunreaktiven Zellen in GFP-markierten, RVLM-projizierenden MLR-Neuronen zwischen nicht trainierten Kontrolltieren und trainierten Ratten (n = 7 für jede einzelne Gruppe; alle Männer). Die Daten wurden mit dem zweiseitigen Welch-T-Test analysiert; Statistische Informationen einschließlich t-Statistikwerten und Freiheitsgraden sind in der Ergänzungstabelle 15 aufgeführt. Die angezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die in den Abbildungen (a, e, i) verwendeten Gehirnschnittbilder wurden von „Paxinos G & Watson C. Das Rattenhirn in stereotaktischen Koordinaten“ übernommen. 6. Aufl. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)“.

Um den MLR → RVLM-Weg anterograd zu verfolgen, führten wir bilaterale Injektionen in die Region über CnF und PPTg mit einem Adeno-assoziierten Virusvektor (AAV) durch, der für ChIEF, eine Channelrhodopsin-Variante, fusioniert mit tdTomato, kodiert (Abb. 1e, f). ChIEF-tdTomato-markierte, von MLR abgeleitete Axone waren im ventralen Teil der Medulla reichlich verteilt (Abb. 1g); Darüber hinaus waren die von MLR abgeleiteten axonalen Schwellungen, die den vesikulären Glutamattransporter 2 (VGLUT2) enthielten, eng mit Zellkörpern und Dendriten von RVLM C1-Neuronen verbunden (Abb. 1h), was darauf hindeutet, dass synaptischer Kontakt zwischen glutamatergen MLR → RVLM-Neuronen und RVLM C1-Neuronen besteht . Insgesamt deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass der RVLM monosynaptische glutamaterge bilaterale Projektionen vom MLR empfängt.

Als nächstes stellten wir die Frage, ob der MLR → RVLM-Signalweg durch Laufübungen aktiviert wird. Wir untersuchten die Expression von Fos, einem biochemischen Korrelat der erhöhten Feuerung, in MLR → RVLM-Projektionsneuronen nach freiwilligem Laufen bei Ratten, die bilaterale RVLM-Injektionen eines retrograden AAV (AAVrg) erhalten hatten, das für EGFP kodiert; Diese Ratten wurden darauf trainiert, sich an freiwillige Laufbandübungen zu gewöhnen (Abb. 1i). In Übereinstimmung mit den Beobachtungen von Ratten, denen CTb injiziert worden war, führte die AAVrg-Transduktion von RVLM-projizierenden Neuronen zu einer dichten Lokalisierung von EGFP-markierten, nichtcholinergen Zellkörpern im MLR über CnF und PPTg (ergänzende Abbildung 1a, b). Freiwilliges Laufen auf dem Laufband (16 m/min für 40 Minuten) erhöhte die Fos-Expression in EGFP-markierten (d. h. RVLM-projizierenden) MLR-Neuronen im Vergleich zur Kontrolle ohne Training (Abb. 1j, k). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass freiwillige Laufübungen den MLR → RVLM-Weg aktivieren, was mit der Annahme übereinstimmt, dass dieser monosynaptische Weg Teil des zentralen Schaltkreismechanismus ist, der die willentliche zentrale Befehlssignalisierung für Laufübungen vermittelt.

Eine erhöhte Fos-Expression nach Laufbandtraining wurde auch in ChAT-immunreaktiven PPTg-Neuronen beobachtet (ergänzende Abbildung 1c, d). Erregte cholinerge PPTg-Neuronen können bei der Beschleunigung, aber nicht beim Auslösen der Fortbewegung während des Lauftrainings eine Rolle spielen33.

Um die Rolle von MLR → RVLM-Neuronen bei der autonomen kardiovaskulären Regulation zu untersuchen, untersuchten wir die Wirkung der optogenetischen Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen auf den arteriellen Druck (AP) und die Herzfrequenz (HR). Bei mit Urethan anästhesierten Ratten, bei denen die MLR-Neuronen ChIEF-tdTomato oder palGFP (Kontrolle) über AAV-Injektionen in den MLR exprimierten (Abb. 1e–h), wurde der RVLM bilateral mit 5 ms gepulstem blauem Laserlicht beleuchtet (473). nm Wellenlänge) mit 10 mW Leistung (bei kontinuierlicher Aktivierung) zur Photostimulation der MLR → RVLM neuronalen Axone durch in das Gehirn eingeführte optische Fasern (ergänzende Abbildung 2a). Eine Pulsreihe mit entweder 20 oder 40 Hz für 2 Minuten löste bei ChIEF-tdTomato-exprimierenden Ratten konsistent Druck- und Tachykardiereaktionen aus, jedoch nicht bei palGFP-exprimierenden Kontrollen (ergänzende Abbildung 2b, c). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass angeregte MLR → RVLM-Neuronen autonome kardiovaskuläre Reaktionen hervorrufen, was uns dazu veranlasste, die sympathoexzitatorische Rolle des monosynaptischen MLR → RVLM-Signalwegs direkt mit der elektrophysiologischen Aufzeichnung der renalen sympathischen Nervenaktivität (RSNA) zu untersuchen.

Bei anästhesierten Ratten, bei denen RVLM-projizierende Neuronen mit GFP oder Kontroll-EGFP markiertes Channelrhodopsin-2 (ChR2) über bilaterale Injektionen von AAVrg in das RVLM exprimierten (ergänzende Abbildung 1a, b), wurde der MLR bilateral beleuchtet, um die Zellkörper zu fotostimulieren /Dendriten von MLR → RVLM-Neuronen (Somata-Targeting) in intermittierender Weise, d ein 1,5-s-Intervall für 1 Minute; Anschließend wurden die Auswirkungen dieses Verfahrens auf RSNA untersucht (Abb. 2a). Die Photostimulation löste eine renale Sympathoexzitation (RSNA) aus, die mit jedem Zyklus von 0,5-s-Beleuchtungsimpulsen synchron war und von einem Anstieg des AP, jedoch nicht der HR während der 1-minütigen Stimulationsperiode begleitet war (Abb. 2b). Überlagerungs- und Mittelungsanalysen der RSNA-Änderungen über 30 Interventionszyklen hinweg (Abb. 2c) zeigten, dass die Pulsserie bei 10 oder 20 Hz, jedoch nicht bei 40 Hz, signifikant eine renale Sympathoexzitation auslöste, worauf eine schnelle Sympathoinhibition und eine Rückkehr zu den Werten vor der Photostimulation folgte (Abb. 2d). Die sympathoexzitatorische Komponente als Reaktion auf die Photostimulation bei 40 Hz, gemessen anhand der Fläche unter der Kurve (AUC) für die Änderungen der RSNA (Abb. 2c), war 29 % kleiner als die bei 20 Hz (P = 0,034, zweiseitig). gepaarter t-Test), möglicherweise aufgrund anästhetischer Wirkungen, da die Photostimulation bei 40 Hz bei nicht anästhesierten dezerebrierten Ratten die RSNA signifikant erhöhte wie die bei 20 Hz (später beschrieben; Abb. 3). Eine Urethananästhesie könnte die Wirkung einer durch Photostimulation mit höherer Frequenz hervorgerufenen wiederkehrenden Hemmung innerhalb des sympathoregulatorischen Schaltkreises verstärken. Als Hinweis auf die Spezifität der sympathoexzitatorischen/sympathoinhibitorischen Reaktionen, die durch optogenetische Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen hervorgerufen wurden, wurde durch Beleuchtung von EGFP-exprimierenden, RVLM-projizierenden MLR-Neuronen bei Kontrollratten keine RSNA-Änderung hervorgerufen (ergänzende Abbildung 3a).

a Optogenetische Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen in anästhesierten Ratten. Pfeile: Positionen der Glasfaserspitzen. b Repräsentative Aufzeichnung während der optogenetischen Stimulation (20 Hz) bei einer ChR2-GFP-exprimierenden anästhesierten Ratte. Aquablaue Hintergründe zeigen Beleuchtungsperioden an. c Überlagerungs- und Mittelungsanalyse, durchgeführt mit RSNA, dargestellt in Panel b. Zeitverläufe (10-ms-Bins) der prozentualen Änderungen der RSNA gegenüber dem Ausgangswert (= 30-s-Mittelwert vor dem ersten optogenetischen Eingriff) während jedes Zyklus (oben) wurden zu jedem Zeitpunkt über 30 Eingriffe (unten) gemittelt. d Zeitverläufe (100-ms-Bins) von ∆RSNA nach Überlagerungs- und Mittelungsanalyse als Reaktion auf intermittierende MLR → RVLM-Neuronenstimulation bei ChR2-GFP-exprimierenden anästhesierten Ratten [n = 9 (7 Männer, 2 Frauen) neben n = 7 (5 Männer, 2 Frauen) bei 10 Hz]. e Wirkung von Glutamatrezeptorblockaden im RVLM auf die RSNA-Reaktion auf MLR → RVLM-Neuronenstimulation (20 Hz) bei ChR2-GFP-exprimierenden anästhesierten männlichen Ratten (n = 6). Pfeile: Positionen der Pipettenspitzen für RVLM-Injektionen. Die Daten wurden mit der einfaktoriellen RM-ANOVA nach Friedman nach Rang analysiert (da der Test auf Normalität oder gleiche Varianz nicht bestanden wurde), gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test (d) oder einem zweiseitigen gepaarten t-Test (e). Statistische Informationen, einschließlich F/t/χ2-Statistikwerte und Freiheitsgrade, sind in der Ergänzungstabelle 15 dargestellt. *P < 0,05 vs. 30-s-gemittelte Basislinie. #P < 0,05 vs. 1-s-Durchschnittswerte unmittelbar vor jeder Photostimulation über 30 Eingriffe. Die Ausgangswerte für die Panels d und e sind in den Ergänzungstabellen 2 bzw. 4 angegeben. Die angezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die in den Abbildungen (a, e) verwendeten Gehirnschnittbilder wurden von „Paxinos G & Watson C. Das Rattenhirn in stereotaktischen Koordinaten“ übernommen. 6. Aufl. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)“.

a Optogenetische Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen in nicht anästhesierten dezerebrierten Ratten. b Eine repräsentative Aufzeichnung während der optogenetischen Stimulation (40 Hz) bei einer ChR2-GFP-exprimierenden dezerebrierten Ratte. c, d Zeitverläufe nach Überlagerungs- und Mittelungsanalyse (c 100-ms-Bins) und während optogenetischer Interventionen (d 10-s-Bins) von ∆RSNA und ∆VRNA als Reaktion auf eine 1-minütige intermittierende Stimulation der MLR → RVLM-Neuronen in ChR2 -exprimierende dezerebrierte männliche Ratten (n = 6). e Wirkung von Glutamatrezeptorblockaden im RVLM auf ∆VRNA- und ∆AP-Reaktionen auf eine 15-sekündige anhaltende Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen (40 Hz), bewertet anhand ihrer integrierten Werte für 15 s, bei ChR2-GFP-exprimierenden, dezerebrierten Männern Ratten (n = 6). Die Daten wurden mittels einfaktorieller RM-ANOVA/einfaktorieller RM-ANOVA nach Friedman nach Rang analysiert, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test (c, d) oder einem zweiseitigen gepaarten t-Test (e). Statistische Informationen, einschließlich F/t/χ2-Statistikwerte und Freiheitsgrade, sind in der Ergänzungstabelle 15 dargestellt. *P < 0,05 vs. 30-s-gemittelte Basislinie. #P < 0,05 vs. 1-s-Durchschnittswerte unmittelbar vor jeder Photostimulation über 30 Eingriffe. Die Ausgangswerte für die Panels (c, d) und (e) sind in den Ergänzungstabellen 5 bzw. 7 angegeben. Die angezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Das in Abbildung (a) verwendete Bild des Gehirnschnitts wurde von „Paxinos G & Watson C. Das Rattenhirn in stereotaktischen Koordinaten“ übernommen. 6. Aufl. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)“.

Da MLR → RVLM-Neuronen VGLUT2 in ihren axonalen Terminals exprimieren (Abb. 1h) und viele RVLM-Neuronen ionotrope Glutamatrezeptoren exprimieren, haben wir untersucht, ob die glutamaterge Übertragung im RVLM zur durch MLR → RVLM-Neuronen vermittelten Sympathoexzitation beiträgt. Die RSNA-Reaktion auf eine 1-minütige intermittierende optogenetische Stimulation (bei 20 Hz) von MLR → RVLM-Neuronen wurde 10–20 Minuten nach bilateralen Injektionen in das RVLM mit Kochsalzlösung (50 nL) oder einer Mischung aus 2-Amino-5-phosphonovaleriansäure getestet und Cyanquixalin (AP5/CNQX; 10 mM in Kochsalzlösung; 50 nL). Im Vergleich zur Behandlung mit Kochsalzlösung führte die Behandlung mit AP5/CNQX zu einer 23 %igen Abnahme der optogenetisch ausgelösten RSNA-Reaktion, gemessen anhand der AUC-Werte für die RSNA-Änderungen (Abb. 2e; ergänzende Abb. 3b). 60 Minuten nach der AP5/CNQX-Behandlung erholte sich die RSNA-Reaktion auf 90 % derjenigen nach der Behandlung mit Kochsalzlösung (P = 0,58; zweiseitiger gepaarter t-Test). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die glutamaterge Übertragung im RVLM zur Signalübertragung MLR → RVLM beiträgt, die die renale Sympathoexzitation antreibt.

Angesichts der Tatsache, dass glutamaterge MLR-Neuronen eine wichtige Rolle bei der Auslösung der Fortbewegung spielen33, 35, 36, 37, fragten wir uns, ob die Erregung von MLR → RVLM-Neuronen nicht nur Sympathoerregung, sondern auch Motoneuronenerregung, nämlich die Aktivierung zentraler Befehle, hervorruft. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, haben wir gleichzeitig Entladungen in peripheren sympathischen und somatomotorischen efferenten Nervenfasern bei dezerebrierten, nicht anästhesierten und gelähmten Ratten aufgezeichnet. Während bei diesem Präparat der Verlust der Hemmung kortikothalamischer Schaltkreise zu einer Überaktivität des Hirnstamms führt, ist es von Vorteil, dass die Auswirkungen von Anästhesie und Bewegungsrückmeldung verworfen werden können. Die enthirnten Ratten, bei denen RVLM-projizierende Neuronen ChR2-GFP exprimierten, empfingen einseitig und intermittierend für 1 Minute Laserimpulse an den MLR, wie oben angegeben (20 mW Laserleistung; Abb. 3a). Die optogenetische Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen erhöhte AP ohne signifikante Auswirkungen auf die Herzfrequenz und erhöhte Entladungen sowohl in den renalen sympathischen als auch in den somatomotorischen Nervenfasern der L5-Ventralwurzel38 (Abb. 3b). Bemerkenswerterweise unterschied sich die Art und Weise der Entladung dieser Nervenfasern während optogenetischer Eingriffe; Die renale Sympathoexzitation (RSNA) wurde sofort und synchron mit jedem Zyklus von 0,5-s-Beleuchtungsimpulsen ausgelöst, wohingegen die Aktivität des ventralen Wurzelnervs (VRNA) während der einminütigen Interventionen allmählich erhöht und aufrechterhalten wurde (Abb. 3b – d). Die anhaltenden Anstiege der VRNA stimmen mit denen früherer Studien überein, in denen die Wirkung der elektrischen Stimulation des MLR bei enthirnten Ratten21 und Katzen39 untersucht wurde. Solche Unterschiede in den Eigenschaften sympathischer und somatomotorischer neuronaler Entladungsreaktionen legen nahe, dass medullospinale Schaltkreise zwischen MLR → RVLM-Neuronen und spinalen Motoneuronen eine Rolle als Tiefpassfilter spielen, während bestimmte medullospinale Schaltkreise stromabwärts des MLR → RVLM-Signalwegs den schnellen Sympathikus vermitteln Nervenreaktionen. Im Gegensatz zur ChR2-vermittelten Aktivierung sympathischer und somatischer motorischer Abflüsse löste die Beleuchtung in EGFP-exprimierenden Kontrollen keine Veränderungen in der VRNA aus (ergänzende Abbildung 3c, d).

An dezerebrierten Ratten haben wir auch getestet, ob die Erregung von Motoneuronen und die kardiovaskulären Reaktionen, die durch die Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen hervorgerufen werden, eine glutamaterge Neurotransmission im RVLM beinhalten. Bilaterale AP5/CNQX-Injektionen in den RVLM reduzierten die Aktivierung von VRNA und die Erhöhung von AP als Reaktion auf eine 15-sekündige Photostimulation von MLR → RVLM-Neuronen signifikant um 64 bzw. 34 % (bewertet durch Integration von VRNA- und AP-Änderungen während der 15-sekündigen Stimulation). Zeitraum) im Vergleich zu denen nach Kochsalzinjektionen (Abb. 3e; ergänzende Abb. 3e). Die VRNA- und AP-Reaktionen erholten sich 60 Minuten nach der AP5/CNQX-Behandlung um 105 bzw. 81 % der Reaktionen nach der Behandlung mit Kochsalzlösung (P = 0,62 bzw. 0,16; zweiseitiger gepaarter t-Test; n = 3). Im Gegensatz dazu hatte die optogenetische Stimulation keinen Einfluss auf die Herzfrequenz (ergänzende Abbildung 3e). Insgesamt erhöhen angeregte MLR → RVLM-Neuronen gleichzeitig die sympathischen vasokonstriktorischen und somatomotorischen Töne, teilweise über glutamaterge Übertragung im RVLM.

Die durch den MLR → RVLM-Signalweg gesteuerte Aktivierung sowohl des sympathischen als auch des somatomotorischen Nervensystems veranlasste uns zu untersuchen, ob die Stimulation dieses Signalwegs sowohl Bewegungsaktivitäten als auch autonome kardiovaskuläre Veränderungen hervorruft, wie sie beim Lauftraining beobachtet werden. Ratten, bei denen RVLM-projizierende Neuronen ChR2-GFP exprimierten oder EGFP über bilaterale AAVrg-Injektionen in das RVLM kontrollierten, wurden einer MLR-Beleuchtung über optische Fasern unterzogen und ihre AP wurde mit einem Drucktelemeter unter frei beweglichen Bedingungen überwacht. Ratten bei Bewusstsein wurden auf einer kreisförmigen Bahn platziert (ID 100 und OD 140 cm), und wenn sie ruhten, aber nicht schliefen oder sich bewegten (z. B. beim Putzen), wurden die Zellkörper der MLR → RVLM-Neuronen unter kontinuierlichen Aufzeichnungen von AP, HR und Verhalten beleuchtet (Abb. 4a–c).

a Optogenetische Stimulation von MLR → RVLM-Neuronen bei Ratten, die bei Bewusstsein sind und sich frei auf einer kreisförmigen Bahn bewegen können. b GFP-Transduktion in den axonalen Fasern des Marks einer ChR2-GFP-exprimierenden Ratte (Autofluoreszenz). Maßstabsbalken: 1 mm. c GFP- und ChAT-immunreaktive Zellen im Mittelhirn. Sternchen: eine Position der implantierten Glasfaserspitze. Maßstabsbalken: 1 mm. d Repräsentative Aufzeichnung während einer 15-sekündigen optogenetischen Intervention (40 Hz; 20 mW) bei einer ChR2-GFP-exprimierenden Ratte bei Bewusstsein. e Zeitverlauf (3-s-Bins) ändert sich als Reaktion auf eine 15-sekündige anhaltende optogenetische Stimulation (n = 8, außer n = 7 für bilaterale Stimulation, alle Männer). Die Aufzeichnungen jeder Ratte sind in der ergänzenden Abbildung 4a dargestellt. f Repräsentative Aufzeichnung während fünfmal wiederholter intermittierender (5 Sekunden Laser ein/5 Sekunden Laser aus) optogenetischer Eingriffe (40 Hz; 20 mW) bei einer ChR2-GFP-exprimierenden Ratte bei Bewusstsein. Pfeile: Trennung der Telemetriesignale. Diese Aufzeichnung wurde in die Ergebnisse einbezogen, da die Trennung nach optogenetischen Eingriffen erfolgte. g Zeitverlauf (5-s-Bins) ändert sich während fünfmal wiederholter optogenetischer Stimulationen (n = 8, außer n = 7 für bilaterale Stimulation). Die Spuren jeder Ratte sind in der ergänzenden Abbildung 4c dargestellt. Die Daten wurden mithilfe der einfaktoriellen RM-ANOVA/Friedman-einfaktoriellen RM-ANOVA nach Rang analysiert, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test [e, g]. Statistische Informationen einschließlich F/t/χ2-Statistikwerten und Freiheitsgraden sind in der Ergänzungstabelle 15 dargestellt. *P < 0,05 vs. 15-s-gemittelter Basiswert. Die in den Panels (d) und (f) gezeigten Overhead-Ansichten während der Aufzeichnungen werden in den Zusatzfilmen 1 bzw. 2 berichtet. Die Ausgangswerte für die Panels (e) und (g) sind in den Ergänzungstabellen 8 bzw. 9 angegeben. Die angezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Das in Abbildung (a) verwendete Bild des Gehirnschnitts wurde von „Paxinos G & Watson C. Das Rattenhirn in stereotaktischen Koordinaten“ übernommen. 6. Aufl. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)“.

Die einseitige Beleuchtung von ChR2-GFP-exprimierenden, MLR → RVLM-Neuronenzellkörpern für 15 s mit gepulstem blauem Laserlicht bei 40 Hz (20 mW Laserleistung) erhöhte sofort die AP und löste verspätet Tachykardie aus. Während des gesamten Stimulationszeitraums löste die Photostimulation auch eine Ganzkörperbewegung oder ein Laufen aus, ohne die Fähigkeit zum Bremsen oder Drehen zu beeinträchtigen (Abb. 4d, e; ergänzende Abb. 4a; ergänzender Film 1). Darüber hinaus lösten fünfmal wiederholte einseitige optogenetische Eingriffe, bei denen ein Zyklus aus 5-sekündigem Laser-Ein und 5-s-Laser-Aus bei 40 Hz (20 mW) bestand, ebenfalls Druckreaktionen und nachfolgende tachykarde und lokomotorische Reaktionen aus, die zuverlässig waren synchron mit jeder Folge von 5-s-Beleuchtungsimpulsen (Abb. 4f, g; ergänzende Abb. 4c; ergänzender Film 2). Die Distanzen, die die Ratten zurücklegten/liefen, und die kardiovaskulären Reaktionen während dieser Photostimulationen (bewertet durch Integration während der Stimulationsperiode) waren frequenzabhängig zwischen 10, 20 und 40 Hz (bei 20 mW) und intensitätsabhängig zwischen 10, 20 und 35–40 mW (bei 40 Hz) (Ergänzende Abbildung 4b, d). Die bilaterale optogenetische Stimulation löste ähnliche Bewegungs- und Herz-Kreislauf-Reaktionen aus wie die einseitige Stimulation (Abb. 4e, g). Die MLR-Beleuchtung in EGFP-exprimierenden Kontrollen rief jedoch keine Fortbewegung oder kardiovaskuläre Veränderungen hervor (ergänzende Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass angeregte MLR → RVLM-Neuronen sowohl Fortbewegung als auch Herz-Kreislauf-Reaktionen steuern, was die Annahme unterstützt, dass zentrale Befehlssignale, die über den MLR → RVLM-Weg übertragen werden, eine Rolle bei der Koordination der Bewegungen der Bewegungsglieder und der autonomen Herz-Kreislauf-Kontrollen spielen, die für Laufübungen erforderlich sind.

Die optogenetische Stimulation der neuronalen Zellkörper MLR → RVLM löste bei anästhesierten oder dezerebrierten Ratten keine Tachykardie aus (Abb. 2, 3), wahrscheinlich weil der RVLM überwiegend die sympathische vasomotorische Aktivität und nicht die Herzfunktionen steuert 25, 26, 27, 28. Unterdessen erhöhte diese Stimulation bei wachen Ratten die Herzfrequenz (Abb. 4). Die tachykarde Reaktion könnte sekundär zur lokomotorischen Reaktion sein. Die Aktivierung des auf der Skelettmuskulatur basierenden Reflexes (d. h. des Belastungsdruckreflexes) aufgrund der Bewegung oder der Kontraktion der Gliedmaßenmuskulatur bei wachen Ratten sollte an der HR-Reaktion beteiligt sein40. Es ist auch wahrscheinlich, dass die Stimulation des MLR → RVLM-Signalwegs anschließend andere zentrale Schaltkreise aktiviert, die wiederum kardiovaskuläre Reaktionen hervorrufen. Beispielsweise reguliert der MLR den kortikalen Zustand parallel zur Fortbewegung41.

Wir untersuchten auch, ob ein anderer RVLM-projizierender sympathoexzitatorischer Signalweg die Fortbewegung vermittelt. Der hypothalamische paraventrikuläre Kern (PVN) enthält eine Fülle von RVLM-projizierenden Neuronen, deren selektive Stimulation bei anästhesierten Ratten eine Sympathoerregung hervorruft42. Wir fanden heraus, dass die optogenetische Stimulation des PVN → RVLM-Signalwegs bei sich frei bewegenden und wachen Ratten die AP erhöhte, jedoch nie eine Fortbewegung hervorrief (ergänzende Abbildung 6). Im Gegensatz zum MLR → RVLM-Signalweg ist der sympathoexzitatorische PVN → RVLM-Signalweg daher nicht an der somatischen motorischen Steuerung der Fortbewegung beteiligt.

Um die Notwendigkeit von MLR → RVLM-Neuronen bei der somatisch-autonomen motorischen Integration für Bewegungsaktivitäten zu untersuchen, haben wir getestet, ob die Hemmung dieses Signalwegs während freiwilliger Laufübungen sowohl die Bewegungsaktivität als auch die kardiovaskulären Reaktionen abschwächt. Um MLR → RVLM-Neuronen optogenetisch zu hemmen, kombinierten wir das Cre-abhängige Expressionssystem mit anterograden und retrograden AAVs, um MLR → RVLM-Neuronen selektiv mit einem chloridleitenden Channelrhodpsin iChloC, fusioniert mit mCherry oder Kontroll-eYFP, zu transduzieren; Anschließend wurde das MLR beidseitig mit blauen Laserpulsen beleuchtet43 (Abb. 5a). iChloC-mCherry oder eYFP wurde in 79 ± 5 % der Cre-exprimierenden MLR-Neuronen exprimiert (n = 10 Ratten, bei denen die Cre-Immunfärbung erfolgreich war; Abb. 5b). Die iChloC-mCherry/eYFP-markierten Axone waren im RVLM reichlich verteilt, wobei die Axonterminals den RVLM-C1-Neuronen gegenüberstanden (Abb. 5c), was auf synaptische Kontakte zwischen den markierten MLR → RVLM-Neuronen und den RVLM-C1-Neuronen hindeutet.

a Optogenetische Hemmung von MLR → RVLM-Neuronen wacher Ratten, die sich in einem Käfig mit einem fliegenden Untertassenrad frei bewegen können. b Cre-abhängige iChloC-mCherry-Expression in MLR → RVLM-Neuronen. Sternchen: Position der Glasfaserspitze. Maßstabsbalken: 1 mm (links); 20 μm (rechts). c Verteilung mCherry-immunreaktiver Axone in der Medulla (links); Die Schwellungen standen in engem Gegensatz zu den neuronalen Dendriten und Zellkörpern von RVLM C1 (Sternchen; rechts). Maßstabsbalken: 1 mm (links); 10 μm (rechts). d Repräsentative Bewegungsgeschwindigkeit und kardiovaskuläre Veränderungen als Reaktion auf eine 2-sekündige optogenetische Hemmung während des Radlaufs bei einer iChloC-mcherry-exprimierenden Ratte. WRR, Raddrehrate. Die Draufsicht während der Aufzeichnung wird im Zusatzfilm 3 beschrieben. e Der Zeitverlauf (200-ms-Bins) ändert sich als Reaktion auf einen 2-sekündigen optogenetischen Eingriff während des Laufens bei eYFP-exprimierenden Kontrollen (n = 4) und iChloC-mCherry-exprimierenden männlichen Ratten (n = 7). Grau: Einzeldaten, gemittelt über Versuche. f Vergleiche zwischen Kontrollen (45 Versuche/4 Ratten) und iChloC-mCherry-exprimierenden Ratten (96 Versuche/7 Ratten): integriertes ∆WRR und ΔMAP für 5 s nach Beginn der 2-sekündigen optogenetischen Intervention während des Laufens. Der Vorbeleuchtungspegel wurde als Mittelwert während des 2-s-Zeitraums unmittelbar vor der Laserbeleuchtung bestimmt. Horizontale Balken, Mittelwerte. g Diagramme von ∫ ΔMAP vs. ∫ΔWRR in jedem laufenden Versuch. Viele Parzellen von iChloC-mCherry-exprimierenden Ratten verteilt im dritten Quadranten. h Vergleiche der Versuchsprozentsätze zwischen Kontrollen und iChloC-mCherry-exprimierenden Ratten sowie zwischen Mustern von ∫ ΔWRR und ∫ ΔMAP. i Vergleich zwischen Kontrollen (39 Versuche/4 Ratten) und iChloC-mCherry-exprimierenden Ratten (69 Versuche/7 Ratten) von ∫ ΔMAP in Ruhe. Die Daten wurden mittels einfaktorieller RM-ANOVA gefolgt von Holm-Sidaks Post-Hoc-Test oder Friedmans einfaktorieller RM-ANOVA nach Rang analysiert, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test (e), zweiseitigem Welch-t-Test (f), zweiseitig RM-ANOVA gefolgt von Tukey-Test (h) oder Mann-Whitney-U-Test (i). Statistische Informationen, einschließlich statistischer F/t/χ2-Werte und Freiheitsgrade, sind in der Ergänzungstabelle 15 dargestellt. *P < 0,05 vs. 2-s-durchschnittliches Vorbeleuchtungsniveau unmittelbar vor dem optogenetischen Eingriff (e). †P < 0,05 im Vergleich zu allen anderen Versuchen in jeder Gruppe (h). ‡P < 0,05 vs. Kontrollen in jedem Muster (h). Die Basiswerte für die Panels (e–h) und (i) (= Vorbeleuchtungsniveau) sind in den Ergänzungstabellen 13 bzw. 14 angegeben. Die angezeigten Daten sind Mittelwerte ± SEM. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Das in Abbildung (a) verwendete Bild des Gehirnschnitts wurde von „Paxinos G & Watson C. Das Rattenhirn in stereotaktischen Koordinaten“ übernommen. 6. Aufl. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)“.

Bewusste Ratten, die für optogenetische Manipulation und telemetrische AP-Messungen ausgerüstet waren, durften sich in einem würfelförmigen Käfig [45 × 45 × 40 (Höhe) cm], der ein horizontales Laufrad mit einem Durchmesser von 36 cm enthielt, frei bewegen (Abb. 5a). . Beim spontanen Laufen auf dem Rad oder im Ruhezustand auf dem Käfigboden wurde der MLR 2 s lang beidseitig mit einem gepulsten 50-ms-Laser (10 mW bei 10 Hz) beleuchtet43. Es wurde bestätigt, dass dieser optogenetische Ansatz die neuronale Erregung von MLR → RVLM durch immunhistochemische Färbung von Fos wirksam hemmt. Die Fos-Expression wurde in MLR → RVLM-Neuronen durch ChR2-vermittelte optogenetische Aktivierung ihrer Zellkörper unter Narkose induziert, und diese induzierte Fos-Expression wurde durch gleichzeitige Photoaktivierung von iChloC in diesen Neuronen unterdrückt (ergänzende Abbildung 7).

Bei jeder Ratte mit iChloC-mCherry- oder Kontroll-eYFP-Expression in MLR → RVLM-Neuronen wurden Experimente über 2–4 Tage durchgeführt, wobei die Laserpulsreihe insgesamt 9–17 Versuchen beim Laufen und 5–15 Versuchen im Ruhezustand unterzogen wurde . Auf optogenetische Eingriffe während des freiwilligen Radlaufs folgten bei Versuchen mit jeder Ratte verschiedene Muster von Verhaltensänderungen, wie z. B. erneutes Laufen nach dem Stoppen/Verlangsamen des Laufens oder Stehen auf dem Rad nach dem Stoppen des Laufens (ergänzende Abbildung 8a; ergänzender Film 3). Allerdings betrug die Wahrscheinlichkeit, dass wir das Verhalten des „Durchlaufens“ des 5-Sekunden-Zeitraums nach Beginn der 2-Sekunden-Laserpulsserie beobachteten, bei eYFP-exprimierenden Kontrollen 79 % (50–100 %, n = 4), aber nur 14 % (0–33 %, n = 7) für iChloC-mCherry-exprimierende Ratten (ergänzende Abbildung 8b). Im Gegensatz dazu war die Wahrscheinlichkeit, dass die Bewegungsaktivität während des 5-Sekunden-Zeitraums unterdrückt wurde, bei iChloC-Ratten größer als bei Kontrollen (ergänzende Abbildung 8b); In 37 % (13–57 %) der Laufversuche mit iChloC-Ratten wurde ein Laufen mit einer Pause oder einer Verlangsamung innerhalb des 5-Sekunden-Zeitraums beobachtet, während dieses Verhaltensmuster bei keiner Kontrolle beobachtet wurde. „Stehen auf dem Rad nach Stoppen des Laufens“ 5 s nach Beginn des Laserpulses wurde bei 7 % (0–21 %) der Kontrollen, aber bei 24 % (14–35 %) der iChloC-Ratten beobachtet. Darüber hinaus wurde in 8–30 % der Versuche bei sechs von 7 iChloC-Ratten das Verlassen des Rads zum Käfigboden innerhalb der 5-s-Periode beobachtet, wohingegen drei Kontrollratten dieses Verhalten nie zeigten, abgesehen von einer Kontrollratte, die das Rad in 29 % der Versuche verließ die Prüfungen.

Durch die Mittelung der Veränderungen der Radrotationsrate (WRR) und der kardiovaskulären Veränderungen über alle Laufversuche für jede Ratte fanden wir heraus, dass die optogenetische Hemmung von MLR → RVLM-Neuronen während des Radlaufs hemmende Wirkungen auf die Bewegungsaktivität und die AP-Erhöhung ausübte, ohne die Herzfrequenz zu beeinflussen (Abb. 5d–f). Da sowohl die WRR- als auch die AP-Reduktion unmittelbar nach Beginn der Beleuchtung auftraten und im Durchschnitt eine ähnliche Zeitverlaufskinetik aufwiesen (Abb. 5e; ergänzende Abb. 8c), war die unterdrückte Fortbewegung wahrscheinlich keine Ursache für die AP-Reduktion oder umgekehrt. Bei eYFP-exprimierenden Kontrollen hatte die während des Laufens verabreichte Laserpulsreihe im Durchschnitt keinen Einfluss auf WRR oder kardiovaskuläre Veränderungen (Abb. 5e und f, ergänzende Abb. 8c). Schließlich wurde in 20 % (0–31 %) der Kontrollversuche, aber in 71 % (62–82 %) der iChloC-Ratten, eine gleichzeitige Abnahme von WRR und AP nach optogenetischer Intervention beobachtet, unabhängig von den Verhaltensmustern (Abb. 5g und h). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MLR → RVLM-Neurotransmission die zentrale Befehlssignalisierung vermittelt, die an der Koordination der Bewegungsaktivität und der sympathischen Herz-Kreislauf-Kontrolle während des Lauftrainings beteiligt ist.

Im Gegensatz dazu hatten Laserpulsreihen, die bei ruhenden Ratten verabreicht wurden, weder bei Kontrollpersonen noch bei iChloC-mCherry-exprimierenden Ratten einen Einfluss auf AP oder HR (Abb. 5i; ergänzende Abb. 9). Daher ist es unwahrscheinlich, dass der monosynaptische Weg MLR → RVLM zur basalen kardiovaskulären Homöostase beiträgt.

Unsere funktionellen neuroanatomischen Analysen und physiologischen In-vivo-Experimente in Kombination mit optogenetischer Manipulation bei Ratten ergaben, dass MLR-Neuronen zentrale befehlsgesteuerte erregende, zumindest teilweise glutamaterge Signale an den RVLM übertragen, die sowohl somatomotorische als auch sympathische Ausflüsse während freiwilliger körperlicher Betätigung stimulieren. Die optogenetische Stimulation des monosynaptischen Signalwegs MLR → RVLM löste lokomotorische und autonome kardiovaskuläre Reaktionen aus, wie sie bei Laufübungen beobachtet wurden. Darüber hinaus unterdrückte die selektive Hemmung des MLR → RVLM-Signalwegs die Bewegungsaktivität und reduzierte die Druckreaktion beim freiwilligen Radfahren, hatte jedoch keinen Einfluss auf die basale kardiovaskuläre Homöostase unter Ruhebedingungen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass der subkortikale MLR → RVLM-Weg eine Schlüsselkomponente des zentralen Schaltkreismechanismus darstellt, der willkürliche zentrale Befehlssignale weiterleitet und dadurch die Koordination der autonomen kardiovaskulären Kontrolle und der somatomotorischen Gliedmaßenkontrolle vermittelt, die zur Verbesserung der Fortbewegungsleistung erforderlich ist oder Lauftraining.

Neben dem MLR → RVLM-Weg empfängt der RVLM auch Projektionen vom PAG, wie in Abb. 1c dargestellt. Obwohl der PAG offenbar einen weiteren subkortikalen Schaltkreis für zentrale Befehle darstellt19, ist unbekannt, ob RVLM-projizierende PAG-Neuronen während des Trainings an der autonomen Regulierung beteiligt sind und weitere Untersuchungen erfordern.

Während somatomotorische und autonome Kontrollsysteme traditionell als disparat angesehen wurden44, sind die primitiven Verhaltensweisen von Wirbeltieren, darunter Bewegung, Fortbewegung, Nahrungsaufnahme, Schlafen, die Kampf-oder-Flucht-oder-Einfrieren-Reaktion und der Schmerzreflex, durch koordinierte somatomotorische und autonome Kontrollsysteme gekennzeichnet autonome Regulierung45,46,47. Daher liegt die funktionelle Gehirnarchitektur wahrscheinlich der Feinkoordination somatomotorischer und autonomer Aktivitäten für bestimmte Verhaltensweisen zugrunde, doch ihre Organisation ist derzeit kaum verstanden. In potenzieller Bedeutung für diesen Schaltkreis zeigten doppelte transneuronale Aufzeichnungen bei Ratten das Vorhandensein neuronaler Populationen mit Verbindungen sowohl zu somatischen als auch zu sympathischen motorischen Systemen in diskreten Regionen im gesamten Gehirn48,49,50. Darüber hinaus verursachte die elektrische oder chemische Stimulation eines Bereichs im Hypothalamus oder Mittelhirn gleichzeitig somatomotorische und kardiovaskuläre Veränderungen bei Tieren und Menschen13,14,15,17,18. Regionen, die zuvor neuroanatomisch oder funktionell untersucht wurden, wie PVN50, MLR15,49, RVLM und der laterale paragigantozelluläre Kern (LPGi) in der kaudalen medullären Retikulärformation48 unter anderem13,14,15,17,18,48,49,50, können sind an der somatisch-autonomen motorischen Integration beteiligt und beeinflussen dadurch unterschiedliche Verhaltensweisen. Die kausale Rolle dieser Regionen im Verhalten sowie die diesen Rollen zugrunde liegende Gehirnkonnektivität wurden jedoch nicht erforscht. In der vorliegenden Studie haben wir den MLR → RVLM-Weg als einen zentralen Mechanismus identifiziert, der der somatisch-autonomen motorischen Integration für freiwillige Laufübungen zugrunde liegt. Folglich liefert unsere Studie einen wichtigen Einblick in die Gehirnarchitektur für die physiologische Konditionierung, die zur Maximierung der Trainingsleistung erforderlich ist.

Der MLR → RVLM-Weg scheint eine Schlüsselverbindung darzustellen, über die willkürliche zentrale Befehlssignale für Fortbewegung oder freiwillige Laufübungen das somatomotorische und sympathische Nervensystem beeinflussen. Wie die unterschiedlichen Muster somatomotorischer und sympathischer Nervenentladungen, die durch MLR → RVLM-Neuronenstimulation hervorgerufen werden, belegen (Abb. 3b–d), scheinen erregende Signale von diesem Signalweg unterschiedliche medullospinale Signalwege anzutreiben, die mit spinalen Motoneuronen und sympathischen präganglionären Neuronen verbunden sind. Die intrinsische Organisation, die den MLR → RVLM-Weg funktionell mit Bewegungsaktivitäten oder sympathischen kardiovaskulären Reaktionen verknüpft, war jedoch unklar. Dennoch zeigt unsere Verfolgungsstudie, dass postsynaptische Neuronen, auf die der glutamaterge Signalweg MLR → RVLM abzielt, auch RVLM-C1-Neuronen umfassen (Abb. 1h und 5c), obwohl auch RVLM-Nicht-C1-Neuronen ein Ziel dieses Signalwegs sein können. Sowohl C1- als auch Nicht-C1-Neuronen im RVLM senden axonale Projektionen an sympathische präganglionäre Neuronen im Rückenmark24. Zentrale Befehlssignale über den MLR → RVLM-Weg erhöhen wahrscheinlich den sympathischen vasomotorischen Abfluss durch diese sympathischen prämotorischen RVLM-Neuronen.

In Bezug auf die postsynaptische Konnektivität von MLR → RVLM-Neuronen für die Regulierung des somatomotorischen Nervensystems stellen wir fest, dass die Fortbewegung nicht durch nicht-selektive Stimulation von RVLM-Neuronen bei wachen Nagetieren eingeleitet werden kann51, 52, und diese Ansicht wird auch durch keine Wirkung der Sympathoexzitatrie PVN → RVLM gestützt neuronale Stimulation des Rattenverhaltens (ergänzende Abbildung 6). Somit scheint die von MLR → RVLM-Neuronen angetriebene Fortbewegung die Aktivierung einer speziellen Subpopulation von RVLM-Neuronen zu erfordern, die spezifisch durch diesen monosynaptischen Weg gesteuert wird und exekutive medullospinale Bewegungskreisläufe aktiviert. Zu den wichtigsten Vermittlern zwischen MLR → RVLM-Neuronen und spinalen Bewegungsneuronen können glutamaterge LPGi-Neuronen gehören. Capelli et al.35 zeigten, dass die bedingte Ablation dieser Neuronenpopulation die durch glutamaterge MLR-Neuronen ausgelöste Fortbewegung in transgenen VGLUT2-Cre-Mäusen unterdrückte, was darauf hindeutet, dass glutamaterge LPGi-Neuronen eine modulierende Rolle bei der positiven Abstimmung der durch glutamaterge MLR-Neuronen vermittelten Fortbewegung spielen. Das in unseren Experimenten untersuchte RVLM ist kontinuierlich kaudolateral zum von Capelli et al. untersuchten LPGi positioniert. rostrokaudal am kaudalen Rand des Gesichtskerns liegend, entsprechend den morphologischen Daten in den vorherigen35 und unseren Studien (basierend auf der Verteilung von C1-Neuronen und den Gehirnbereichen für die AAV-Transduktion/Optikkanülenimplantation) sowie dem Standardhirn von Mäusen und Ratten Atlanten. Da sowohl RVLM als auch LPGi Teile der medullären Formatio reticularis sind, die durch eine miteinander verbundene Struktur und ein ausgedehntes Netzwerk von Bahnen gekennzeichnet ist, können MLR → RVLM-Neuronen synaptische Kontakte mit einer spezifischen RVLM-Neuronenpopulation haben, die glutamaterge LPGi-Neuronen und/oder andere reguliert medullospinale Bewegungsneuronen. Es ist auch möglich, dass lokomotorisch steuernde LPGi-Neuronen im medialen Teil des RVLM vermischt sind; Sie können postsynaptisch durch MLR → RVLM-Neuronen gesteuert werden. Während zentrale Befehlssignale, die über MLR → RVLM-Neuronen absteigen, das sympathische Nervensystem über die Aktivierung sympathoregulatorischer RVLM-Neuronen regulieren, können die Signale insgesamt eine andere RVLM-Neuronenpopulation stimulieren, die wiederum ein bestimmtes medullospinales Schaltkreisnetzwerk einschließlich des LPGi für die Fortbewegung aktiviert. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die separaten Downstream-Schaltkreismechanismen von MLR → RVLM-Neuronen für Bewegungsaktivitäten und sympathische Herz-Kreislauf-Reaktionen genau zu bestimmen.

Fortbewegung ist ein Vertreter verschiedener freiwilliger Verhaltensweisen, einschließlich Flucht, Verfolgung und Erkundung, die durch unterschiedliche motorische Willensäußerungen hervorgerufen werden. Es ist ungewiss, ob der MLR → RVLM-Weg, der eine wesentliche Rolle bei freiwilligen Laufübungen spielt, auch an anderen Bewegungsverhaltensweisen beteiligt ist. Dennoch trägt die Aktivierung des MLR sicherlich zur Fortbewegung zur Flucht53 und Verfolgung bei54. Caggiano et al.36 schlugen außerdem vor, dass glutamaterge CnF-Neuronen, die Projektionen vom periaquäduktalen Grau empfangen, die für die Flucht erforderliche schnelle Fortbewegung unterstützen, wohingegen glutamaterge PPTg-Neuronen, die Projektionen von Basalganglien empfangen, für die langsame explorative Fortbewegung notwendig sein könnten. Daher kann der MLR → RVLM-Weg einen gemeinsamen Schlüsselknoten darstellen, der der somatomotorisch-autonomen Kopplung für diese Arten von Bewegungsverhalten zugrunde liegt, auch wenn er afferente Eingaben von unterschiedlichen Schaltkreisen erhalten kann, die durch unterschiedliche motorische Willensimpulse gesteuert werden. Obwohl es derzeit an Beweisen mangelt, können vorgelagerte Schaltkreise, die die Aktivität von MLR → RVLM-Neuronen für freiwillige Laufübungen beeinflussen, Hirnregionen umfassen, die mit der inneren Motivation zusammenhängen, wie das hypothalamische orexinerge System55 und/oder der Nucleus accumbens56, die beide axonale Projektionen zum haben MLR33,57. Obwohl die Stimulation des zusätzlichen motorischen Bereichs, des prämotorischen Bereichs oder des motorischen Kortex bei menschlichen Probanden Muskelzuckungen in Verbindung mit Sympathoerregung auslöst16, liegen keine Informationen über kortikale/subkortikale Verbindungen zur Übertragung zentraler Befehlssignale vor. Während darüber hinaus spekuliert wird, dass die zentralen Befehle ihren Ursprung im Telencephalon als „kortikale Strahlung“ haben2, besteht kein Konsens über die Stelle, die als Ursprung der zentralen Befehlssignale dient58. Vorgeschaltete Schaltkreise, die zentrale Befehlssignale an MLR → RVLM-Neuronen weiterleiten, verdienen eine weitere Untersuchung der Gehirnmechanismen, die den autonomen Herz-Kreislauf-Anpassungen während freiwilliger körperlicher Betätigung zugrunde liegen, ein seit weit über einem Jahrhundert herausragendes Thema1,2 (ergänzende Abbildung 10).

Alle Verfahren wurden vom Animal Care Committee (Ref.-Nr.: 15-Y-40, 18-Y-11, 19-Y-53) und dem Gene Rekombination Experiment Safety Committee (Ref.-Nr.: 28-034, 31-067, 32-061) der Tottori-Universität. In dieser Studie wurden die Sprague-Dawley-Ratten (Slc:SD; männlich und weiblich) von Japan SLC, Inc. verwendet; Sie wurden von Shimizu Laboratory Supplier Co, Ltd gekauft und in unseren Einrichtungen gezüchtet. Alle Ratten wurden in einem klimatisierten Raum bei 25 °C mit einem 12:12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Sie wurden in Standardkäfigen gehalten, mit Ausnahme von Ratten für Experimente zur Untersuchung der Wirkung der optogenetischen Hemmung durch iChloC-Aktivierung, die (nach dem Absetzen) in Käfigen gehalten wurden, die ein fliegendes Untertassenrad (36 cm Durchmesser; Exotic Nutrition) enthielten. Nahrung und Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt. Alle In-vivo-Experimente wurden im klimatisierten Labor bei 25 °C durchgeführt.

Die AAVs zur anterograden Transduktion von MLR-Neuronen mit ChIEF-tdTomato (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato) und mit palGFP (AAV2/1-CMV-palGFP) unter einem CMV-Promotor (die für ChIEF-tdTomato kodierende Genkassette wurde von R. gespendet). . McQuiston: Addgene#32846) und für Cre-abhängige Transduktion von MLR → RVLM-Neuronen mit iChloC-mCherry (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry) (die Genkassette, die iChloC-mCherry kodiert, wurde von P. Hegemann gespendet: Addgene#85467) wurden bereits beschrieben43,59,60. Die Produktion und Reinigung dieser AAVs folgte dem modifizierten Gene Transfer Targeting and Therapeutics Core-Protokoll am Salk Institute (http://vectorcore.salk.edu/protocols.php). Die erforderlichen Plasmide wurden in HEK293T-Zellen transfiziert und AAV wurde aus einem rohen Lysat der Zellen unter Verwendung von OptiPrep (Axis-Shield) gereinigt. Nach der Konzentration über einen Membranfilter (Amicon Ultra-15 NMWL 50 K, Merck) betrugen die endgültigen Titrationen 2,1 × 1011 GC/ml (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato), 3,5 × 1011 GC/ml (AAV2/1). -CMV-palGFP) und 3,4 × 1012 GC/ml (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry). Alle anderen AAVs wurden von Addgene erhalten (AAVrg-hsyn-EGFP, gespendet von B. Roth: Addgene#50465, 7,4 × 1012 GC/ml; AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP, gespendet von E. Boyden: Addgene# 58800, 8,0 × 1012 GC/ml; AAVrg-pgk-Cre, gespendet von P. Aebischer: Addgene#24593, 9,5 × 1012 GC/ml; AAV; AAV2-Ef1a-DIO-EYFP, gespendet von K. Deisseroth: Addgene# 27056, 3,0 × 1012 GC/ml; AAV5-EF1a-DIO-ChR2-eYFP, gespendet von K. Deisseroth: Addgene#35509, 1,0 × 1012 GC/ml). Plasmide und AAVs mit den hier angegebenen Addgene-Nummern wurden im Rahmen von Materialtransfervereinbarungen mit Addgene erhalten.

Mit 1–5 % Isofluran in Sauerstoff anästhesierte, intubierte und künstlich beatmete Ratten (>6 Wochen alt) (SN480–7, Shinano) wurden in einer stereotaktischen Kopfeinheit (900LOS von David Kopf Instruments, Inc. oder SR-6R) positioniert von Narishige). CTb oder eine gegebene AAV-Lösung wurde mithilfe eines kalibrierten Druck-Mikroinjektionssystems (Nanoject II, Drummond Scientific Co.) in die interessierende Gehirnstelle injiziert. Bei Injektionen in den RVLM wurde die dorsale Oberfläche des Marks durch einen Schnitt in der Mittellinie freigelegt, der durch die den Hinterkopf bedeckende Haut gemacht wurde, gefolgt von einer Dissektion der Muskeln, die über der Schädelbasis lagen, und dann eines Schnitts durch den Atlanto -Hinterhauptmembran. Die Koordinaten für die RVLM-Injektionen (1,0 mm rostral und 1,8 mm lateral des Calamus scriptorius; 3,5–3,7 mm ventral der dorsalen Oberfläche der Medulla) entsprachen denen, die ungefähr kaudal des kaudalen Pols der Gesichtskerne lagen. Für Injektionen in den MLR (8,0 mm kaudal, 2,0 mm lateral und 6,3–6,9 mm ventral des Bregma) wurde der Schädel durch einen Mittellinienschnitt der Haut freigelegt und zwei Bohrlöcher in den Schädel gebohrt. Die in das Gehirn injizierten Lösungen waren wie folgt: Alexa-555-konjugiertes CTb (1,0 mg/1 ml PBS, C34776, Thermo Fisher Scientific) (23,0 nL × 4, RVLM), AAV-CMV-ChIEF-tdTomato (46,0 nL ×). 4, MLR), AAV-CMV-palGFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-EYFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP (46,0 nL × 4, MLR), eine Mischung aus AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP und AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (1:1, 46,0 nL × 4, MLR), AAVrg-hsyn-EGFP (23,0 nL × 3, RVLM), AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP (23,0 nL x 3, RVLM) und AAVrg-pgk-Cre (23,0 nL × 3). , RVLM). Nach den Injektionen blieb die Mikropipette 5 Minuten lang eingesetzt, bevor sie herausgezogen wurde.

Bei Ratten, denen CTb injiziert worden war, wurde eine Erholungsphase von 7–11 Tagen gewährt, bis sie einer transkardialen Perfusion unterzogen wurden. AAV-injizierten Ratten, die in Experimenten zur Untersuchung der Fos-Expression in RVLM-projizierenden Neuronen eingesetzt wurden, wurde eine Erholungsphase von 7 Tagen gewährt, bevor das Laufband-Trainingsprogramm begann. Bei den mit AAV injizierten Ratten, die für optogenetische Experimente im anästhesierten oder dezerebrierten Zustand verwendet wurden, wurde vor den Experimenten ein Zeitraum von mindestens 14 Tagen eingeräumt. AAV-Injektionsverfahren für Ratten in bewussten Experimenten, gefolgt von einer zusätzlichen Operation zur intrakraniellen Implantation von Glasfaserkanülen (200 μm Kerndurchmesser, CFML52U-20, Thorlab). Zwei optische Fasern zur bilateralen Beleuchtung des MLR wurden vertikal durch zwei im Schädel angebrachte Bohrlöcher in das Gehirn eingeführt (8,0 mm kaudal, 2,0 mm lateral und 5,5–5,8 mm ventral des Bregma) und zusammen mit den angebrachten Schrauben befestigt Umschließen der Löcher mit Zahnzement. Zur einseitigen Beleuchtung des PVN wurde eine Faser ebenfalls vertikal eingeführt (1,9 mm kaudal, 0,3 mm lateral und 7,9–8,2 mm ventral des Bregma) und befestigt. Den in bewussten Experimenten verwendeten Ratten wurde mehr als 7 Tage Zeit gegeben, bevor sie einer weiteren Operation unterzogen wurden, um ein drahtloses Drucktelemeter für AP-Messungen (TRM54P, Millar, Inc./Kaha Sciences) zu implantieren, was unten beschrieben wird.

Bei mit Isofluran betäubten, intubierten und mechanisch beatmeten Ratten wurde ein Schnitt in der Mittellinie des Abdomens vorgenommen, um die Bauchhöhle freizulegen, und anschließend wurde eine stumpfe Dissektion vorgenommen, um die absteigende Aorta zu erreichen. Während des temporalen Verschlusses der Aorta mit einer 2-0-Seide an der Bifurkation des Beckens und unterhalb der Bifurkation der linken Nierenarterie wurde dann der Drucksensor des Telemeters in die Aorta eingeführt, 1–2 cm rostral vorgeschoben und mit einem chirurgischen Netz fixiert biokompatibler chirurgischer Kleber. Nachdem der Aortenverschluss gelöst war, wurde der Hautschnitt mit einer Naht verschlossen. Experimente an wachen Ratten wurden mindestens eine Woche nach der Telemeter-Implantation durchgeführt.

Um die Erregbarkeit des MLR → RVLM-Signalwegs durch freiwilliges Lauftraining immunhistochemisch zu untersuchen, wurden männliche Ratten, denen bilaterale Injektionen mit AAVrg-hsyn-EGFP in den RVLM verabreicht worden waren, insgesamt drei bis vier Mal pro Woche auf dem Laufband trainiert 14–18 Tage. Am ersten Trainingstag wurden die Ratten für mindestens 30 Minuten auf ein speziell angefertigtes Laufband mit einem an der Rückseite installierten Elektroschockgitter (MK-680C; Muromachi) gesetzt. Anschließend wurden sie 1 Minute lang einem Lauftraining mit 10 m/min und einer Steigung von 0° unterzogen, worauf unmittelbar ein 30-sekündiger Summerton (1 Hz) als Auslöser für den Beginn des Trainings folgte. Diese Sitzung wurde drei- bis fünfmal wiederholt, damit die Ratten den Zusammenhang zwischen dem Summerton und dem Beginn der Übung erlernen konnten. Nach dem zweiten Trainingstag wurden die Ratten einer Laufeinheit pro Tag unterzogen. Die Geschwindigkeit und Dauer des Laufens wurden über 10 Tage hinweg schrittweise auf 20 m/min bzw. 40 min erhöht. Nachdem die Ratten einmal 40 Minuten lang die Laufbandübung mit 20 m/min absolviert hatten, wurden sie für die restlichen Trainingseinheiten 40 Minuten lang einer Laufbandübung mit 16 m/min unterzogen. Wenn die Laufgeschwindigkeit während jeder Trainingseinheit unter die Laufgeschwindigkeit fiel, wurde den Ratten mit dem Schockgitter eine milde, aber aversive elektrische Stimulation des Fußes verabreicht. Den Ratten wurden jedoch nur sehr wenige Schocks verabreicht, da sie mit einem Wattestäbchen sanft angestoßen wurden, als sie das Gitter berühren wollten. Folglich beendeten diese Ratten das Trainingsprogramm und waren in der Lage, freiwillig 40 Minuten lang mit 16 m/min auf dem Laufband zu laufen, ohne Stöße oder Stöße zu erhalten. Zwischen dem letzten Trainingstag und dem Protokolltag war ein Zeitraum von zwei Tagen ohne Training erlaubt.

Am Protokolltag wurden die Ratten zufällig als „Übungsgruppe“ und „Kontrollgruppe“ ausgewählt. Die Übungsratten wurden zum Laufband gebracht, auf dem noch nie Fußschocks verabreicht worden waren, und hielten eine 15-minütige Ruhephase ein. Anschließend, nachdem der Summer 30 Sekunden lang ertönte, wurden sie 40 Minuten lang einem Laufbandtraining mit 16 m/Minute unterzogen. Bei dieser Laufbandübung waren Anstupser unnötig, da die Ratten während des gesamten Zeitraums liefen, ohne sich dem hinteren Teil des Laufbands zu nähern. Die nicht trainierten Kontrollratten wurden auf das Laufband gebracht, aber keiner Bewegung ausgesetzt. Neunzig Minuten nach dem Ende der Belastung oder der Kontrollperiode wurden die Ratten durch Inhalation von 5 % Isofluran in Sauerstoff tief betäubt und dann sofort transkardial perfundiert (wie später beschrieben).

Für Operationen zur Messung peripherer Nervenaktivitäten und kardiovaskulärer Parameter wurde die Ratte mit 1–5 % Isofluran in Sauerstoff anästhesiert, intubiert und mechanisch beatmet. Die rechte Oberschenkelarterie und -vene wurden katheterisiert, um AP über einen Druckwandler (P23XL, Becton, Dickinson & Co.) zu messen bzw. Medikamente zu infundieren. Zwei Nadelelektroden wurden an den Vorderbeinen angebracht, um ein EKG aufzuzeichnen, aus dem die Herzfrequenz anhand der Zeit zwischen aufeinanderfolgenden R-Wellen berechnet wurde. Die Ratte wurde in die stereotaktische Kopfeinheit gelegt. Zur Messung der RSNA wurde die linke Niere retroperitoneal durch einen Schnitt in der linken Flanke freigelegt und anschließend ein Bündel der Nierennervenfasern mit einer bipolaren Elektrode aus Edelstahldraht verbunden. Zur Messung der L5-VRNA wurden eine Laminektomie zur Freilegung des unteren lumbalen Teils des Rückenmarks und ein Einschnitt in die das Rückenmark umgebenden Hirnhautschichten durchgeführt. Das aus der linken ventralen L5-Wurzel gewonnene Nervenbündel wurde sorgfältig isoliert und auf eine isolierte bipolare Edelstahlelektrode gelegt. Anschließend wurde das Bündel distal zur Elektrode durchtrennt und abgebunden. Entladungen der ventralen L5-Wurzel spiegeln Aktivitäten von Motoneuronen wider, die auf die Skelettmuskulatur der Hinterbeine gerichtet sind,61 da die ventralen Wurzeln kaudal von L3 bei Ratten keine Axone sympathischer präganglionärer Neuronen tragen38. Die RSNA- und VRNA-Signale wurden mit einem Wechselstromverstärker (MEG-5200; Nihon-Kohden) mit einem Bandpass-Niederfrequenzfilter von 150 Hz und einem Hochfrequenzfilter von 1 kHz verstärkt, sodass sie hörbar waren. Die freigelegten Nervengewebe wurden in Mineralöl getaucht.

Den Ratten wurden für Experimente unter Narkose intravenös Urethan (600 mg/kg) und α-Chloralose (60 mg/kg) verabreicht. Bei Ratten wurden für Experimente unter nicht betäubten dezerebrierten Bedingungen bilaterale Halsschlagadern abgebunden, um Hirnblutungen während des Dezerebrationsverfahrens zu minimieren. Nach einer parietalen Kraniotomie wurde das Gehirn mit einer Klinge auf präkollikulärer Ebene koronal durchtrennt. Das gesamte Nervengewebe rostral des Schnitts und das das Kleinhirn bedeckende kortikale Gewebe wurden abgesaugt.

Um Laserlicht in die Zielregion zu bringen, wurden faseroptische Kanülen verwendet, die mit einem diodengepumpten Festkörperlaser mit einer Wellenlänge von 473 nm (BL473T8-200; Shanghai Laser and Optic, Co.) verbunden waren, der von einem Impulsgenerator gesteuert wurde ( SEN-7103; Nihon Kohden oder STOmk-2; BRC Co.) über ein Mono- oder verzweigtes Glasfaser-Patchkabel in das Gehirn eingeführt. Vor dem Einführen wurde die Laserausgangsintensität an der Spitze jeder Kanüle mit einem Messgerät (LPM-100; BRC Co.) gemessen. Für die bilaterale RVLM-Beleuchtung wurden zwei Kanülen in einem Winkel vertikal zur dorsalen Oberfläche des Hirnstamms (1,0 mm rostral und 1,8 mm lateral des Calamus scriptorius) in den Hirnstamm eingeführt, wobei sich die Kanülenspitzen 3,0–3,2 mm rostroventral von der Oberfläche entfernt befanden. Zur Beleuchtung des MLR wurden die Spitzen der Kanülen senkrecht in das Gehirn eingeführt (8,0 mm kaudal, 2,0 mm lateral und 5,5–5,8 mm ventral des Bregma bei anästhesierten, nicht enthirnten Ratten; 0,2–0,5 mm rostral und 2,0 mm). lateral der Grenze der Colliculi inferior und superior und 3,5 mm ventral der dorsalen Oberfläche der Colliculi bei enthirnten Ratten). Nachdem alle chirurgischen Eingriffe abgeschlossen waren, wurde die Ratte von Isofluran befreit. Es ließ mindestens 60 Minuten vergehen, bevor mit den Versuchsprotokollen begonnen wurde.

Bei spontan atmenden, mit Urethan betäubten Ratten, die bilaterale Injektionen in den MLR mit AAV-CMV-ChIEF-tdTomato oder AAV-CMV-palGFP erhalten hatten, wurde der RVLM beidseitig mit 5-ms-Impulsen bei 20 oder 40 Hz laserbeleuchtet 30 s. Die Laserleistung wurde bei kontinuierlicher Beleuchtung auf 10 mW voreingestellt. Bei mit Urethan anästhesierten oder dezerebrierten, nicht anästhesierten Ratten, die bilaterale Injektionen von AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP oder AAVrg-hsyn-EGFP in den RVLM erhalten hatten, erfolgte eine 1-minütige intermittierende (0,5-s-Pulsbeleuchtung mit einem 1,5-s-Intervall). ; 30 Kämpfe) oder 15 Sekunden lang anhaltende Photostimulation des MLR bei 10, 20 oder 40 Hz mit einem 5-ms-Laserimpuls (10 mW Laserleistung bei anästhesierten Ratten und 20 mW bei enthirnten Ratten). Die enthirnten Ratten wurden durch intravenöse Infusion von Pancuroniumbromid (0,5 mg/kg Körpergewicht) vorläufig gelähmt. Während der Datenerfassung wurde die Frequenz für die mechanische Beatmung auf 70 Atemzüge/Minute eingestellt, was nicht mit der für die periodische Photostimulation synchronisiert war (0,5 Sekunden Laser ein und 1,5 Sekunden Laser aus). Dies wurde durchgeführt, um die möglichen Auswirkungen des durch Lungeninflation verursachten sympathischen Ausflusses auf die RSNA-Reaktionen auf die periodische Photostimulation zu randomisieren21,61. Die Reihenfolge der Stimulationshäufigkeit war zufällig und zwischen den Manövern waren Intervalle von mindestens 10 Minuten zulässig.

Eine Mischung aus den ionotropen Glutamatrezeptor-Antagonisten 2-Amino-5-phosphonopentansäure (AP5; A5282; Merck) und wasserlöslichem 6-Cyano-7-nitro-chinoxalin-2,3-dion (CNQX; ab120044; Abcam) (10 mM jeweils in Kochsalzlösung) wurde bilateral in den RVLM injiziert, um die glutamaterge Übertragung im RVLM zu hemmen. Die Injektionen erfolgten mit dem NANOJECT II-Mikroinjektionssystem transkraniell über Bohrlöcher im Schädel (12,5 mm kaudal, 1,8 mm lateral und 10,5–10,8 mm ventral des Bregma) oder durch die dorsale Oberfläche des Marks, wie oben angegeben. Nach den bilateralen Injektionen von Kochsalzlösung oder AP5/CNQX (46,0 nl/Stelle) betrug die Dauer bis zur Photostimulation 5–20 Minuten.

Nachdem die Datenerfassung abgeschlossen war, wurden die faseroptischen Kanülen und/oder Mikropipetten wiederholt in das Gehirn eingeführt und daraus entfernt, um Narben für die nachträgliche Bestätigung der Spitzenpositionen zu erzeugen. Der Nierennerv und das ventrale Wurzelbündel wurden zwischen der Elektrode und der Neuralachse durchtrennt, um das Hintergrundrauschen von RSNA bzw. VRNA zu messen. Die Ratten wurden mit einer zusätzlichen intravenösen Infusion von Urethan und α-Chloralose oder Inhalation von 5 % Isofluran in Sauerstoff tief betäubt und anschließend einer transkardialen Perfusion unterzogen, wie später beschrieben.

Männliche Ratten, denen bilaterale Injektionen in den RVLM mit AAVrg-hsyn-EGFP oder AAVrg-hsyn-ChR2-GFP und denen faseroptische Kanülen sowie ein Telemetriesender implantiert worden waren, wurden Experimenten unterzogen, um Veränderungen in AP, HR ( berechnet aus AP-Wellen) und Verhalten im Bewusstseinszustand, wenn der MLR oder PVN über die Kanülen laserbeleuchtet wurde. Vor dem Versuchstag durften sich die Ratten 1–1,5 Stunden lang frei auf einer Kreisbahn bewegen und sich an die Versuchsumgebung gewöhnen. Der Innen- und Außendurchmesser der Schiene betrug 100 bzw. 140 cm, während die Innen- und Außenwandhöhen 30 bzw. 40 cm betrugen. Die Innenwand bestand aus schwarzem, mit Polyvinylchlorid umwickeltem Polyethylen, während die Außenwand aus transparenter Acrylplatte bestand. Der Untergrund der Strecke bestand aus glattflächigen, dunkelgrünen oder schwarzen Gummiplatten.

Am Versuchstag wurden die faseroptischen Kanülen für die MLR-Beleuchtung über ein 1,5 m langes mono- oder verzweigtes faseroptisches Patchkabel, 1 × 1 faseroptisches Rotationskabel, mit einem diodengepumpten Festkörperlaser mit einer Wellenlänge von 473 nm verbunden Verbindung und FC-FC-Patchkabel. Die Laserleistung für die MLR-Beleuchtung wurde vorab mit anderen faseroptischen Kanülen angepasst, die die gleiche Laserübertragungseffizienz wie die implantierten Kanülen hatten. Die Ratte konnte sich bei Bewusstsein auf der kreisförmigen Bahn frei bewegen und ließ mindestens 30 Minuten Zeit, bevor die Experimente begannen. Bei der ruhenden Ratte (die nicht schläft oder sich aktiv bewegt, z. B. beim Gehen oder Putzen), wurde der MLR einseitig oder beidseitig mit 5-ms-Laserimpulsen bei 10, 20 oder 40 Hz beleuchtet, nachdem 15 s lang Basisdaten gesammelt wurden. Lichtimpulse wurden 15 Sekunden lang anhaltend oder intermittierend in fünfmaliger Wiederholung für 5 Sekunden Laser-Ein mit einem 5-Sekunden-Intervall abgegeben. Bei anderen Ratten, die zur Untersuchung der Wirkung der neuronalen PVN → RVLM-Anregung verwendet wurden, wurde das PVN ebenfalls einseitig mit einem Laser beleuchtet. In allen Fällen, in denen es während optogenetischer Eingriffe länger als 1 s zu einer Unterbrechung der Telemetriesignale kam, wurden die Daten verworfen. Bei Unterbrechungen > 1 s nach optogenetischen Eingriffen (z. B. Abb. 4f) wurden die Daten in die Analysen einbezogen. Bei jeder Ratte wurden an einem Versuchstag 2–6 Versuche in zufälliger Reihenfolge durchgeführt, wobei zwischen den Versuchen ein Abstand von mindestens 10 Minuten eingehalten wurde. Die Versuchstage lagen mindestens 2 Tage auseinander.

Mit Isofluran betäubte männliche oder weibliche Ratten, die bilaterale Injektionen in den RVLM mit AAVrg-hsyn-EGFP und in den MLR mit AAV-Ef1a-DIO-eYFP, AAV-Ef1a-DIO-ChR2-eYFP oder einer Mischung aus AAV- Ef1a-DIO-ChR2-eYFP und AAV-Ef1a-DIO-iChloC-mcherry wurden mechanisch beatmet und über eine Oberschenkelvene kanüliert. Die Glasfaserspitzen wurden zur MLR-Beleuchtung in das Gehirn eingeführt (4,5 mm ventral zum Bregma). Anschließend wurde der MLR unter Narkose mit intravenöser Infusion von Urethan und α-Chloralose bilateral und intermittierend (10 Sekunden an/10 Sekunden aus, 90 Mal) 30 Minuten lang mit einem 50 ms langen gepulsten blauen Laser (10 mW, 10 Hz). Fünfundvierzig Minuten nach dem Ende der Beleuchtung wurden die Tiere transkardial mit 4 % Paraformaldehyd perfundiert, und dann wurde das Gehirn einer immunhistochemischen Färbung unterzogen, um die Fos-Expression wie unten beschrieben zu kennzeichnen.

Junge männliche Ratten (4–6 Wochen alt) wurden in Gruppen aus Acrylglaskäfigen gehalten, die ein fliegendes Untertassenrad mit 36 ​​cm Durchmesser (Exotic Nutrition) enthielten. Infolgedessen waren sie bereit, spontan mit dem Rad zu fahren, als sie der Studie unterzogen wurden. Nach Erreichen der Reife (> 9 Wochen alt) erhielten diese Ratten bilaterale Injektionen mit AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry oder AAV-Ef1a-DIO-EYFP in den MLR und mit AAVrg-pgk-Cre in den RVLM, und das waren sie auch implantiert mit faseroptischen Kanülen und einem Telemetriesender (wie oben beschrieben). Das Experiment wurde während der Dunkelphase durchgeführt. Am Versuchstag wurden die faseroptischen Kanülen über Patchkabel und Drehgelenk mit dem Laser verbunden und die Leistungsabgabe für die MLR-Beleuchtung auf 10 mW voreingestellt.

Nachdem man die Ratte bei Bewusstsein in einem würfelförmigen Käfig aus Acrylglas [45 × 45 × 40 (Höhe) cm], der das fliegende Untertassenrad enthielt, frei herumlaufen ließ, ließ man vorher einen Zeitraum von mindestens 30 Minuten verstreichen Die Experimente begannen. Am Radrand wurden in gleichmäßigen Abständen vier kleine Vorsprünge angebracht; Diese konnten leicht mit einer Stange in Kontakt gebracht werden, die im Käfig platziert und über eine Feder mit einem Kraftaufnehmer (FT03; Grass Instruments) verbunden war. Folglich konnte die Radrotationsrate (WRR) anhand der Zeitintervalle zwischen den Spannungsentwicklungsereignissen aufgrund der Kontakte zwischen den Vorsprüngen und der Stange berechnet werden. Während die Ratte freiwillig auf dem Rad lief oder auf dem Boden ruhte (nicht schlief oder sich bewegte, z. B. beim Putzen), wurde der MLR 2 s lang beidseitig mit 50-ms-Impulsen bei 10 Hz beleuchtet43. Die Beleuchtung während des Laufens begann mindestens 2 s nach Beginn des spontanen Laufens. An einem Tag wurden für jede Ratte nach dem Zufallsprinzip 5–13 Versuche in Ruhe oder beim Laufen durchgeführt, wobei zwischen den Versuchen ein Abstand von mindestens 5 Minuten zulässig war. Die Versuchstage lagen für jede Ratte mindestens zwei Tage auseinander.

Ratten, die mit einer zusätzlichen intravenösen Urethaninfusion oder Inhalation von 5 % Isofluran in Sauerstoff tief anästhesiert wurden, wurden transkardial mit heparinisierter Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4). Die Gehirne wurden entnommen, 2 Stunden lang im gleichen Fixiermittel bei 4 °C nachfixiert und dann 24–48 Stunden lang bei 4 °C in eine 30 %ige Saccharoselösung überführt. Mit einem Kryostat (CM1900, Leica, Wetzlar, Deutschland oder HM505 E, GMI, Ramsey, MN, USA) wurden 30 μm dicke koronale oder sagittale Hirnschnitte hergestellt.

Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden die Gewebeschnitte in PBS gewaschen (2 Waschgänge × 10 Min.) und in einer Antikörperlösung (PBS mit 0,3 % Triton L normales Eselsserum) für 2 h bei Raumtemperatur. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C in einer primären Antikörperlösung inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte nach dem Spülen in PBS mit 0,03 % Triton 2 × 10 Min.) im Dunkeln. Schließlich wurden die Schnitte auf Objektträger montiert und mit flüssigem Eindeckmittel (P36930; Thermo Fisher Scientific) abgedeckt. Digitale Bilder der gefärbten Schnitte wurden mit einem digitalen Mikroskop (BZ-9000 oder BZ-X710; Keyence) oder einem konfokalen Mikroskop (LSM780; Carl Zeiss) aufgenommen.

Die verwendeten Primärantikörper waren wie folgt: Hühner-Anti-Tyrosin-Hydroxylase (1:500; ab76442, Abcam), Ziegen-Anti-Cholin-Acetyltransferase (1:100 oder 1:200; AB144P, Merck), Ziegen-Anti-GFP (1:1000). ; GTX26673, GeneTex, Irvine, CA, USA), Ziegen-Anti-tdTomato (1:500; AB8181, Sicgen), Maus-Anti-Cre-Rekombinase (1:1000; MAB3120, Merck), Kaninchen-Anti-c-Fos (1: 400; 2250s, Cell Signaling Technology), Kaninchen-Anti-GFP (1:1000; A-6455, Invitrogen), Kaninchen-Anti-RFP (1:1000; 600-401-379, Rockland), Kaninchen-Anti-Tyrosinhydroxylase (1 :1000; AB152, Merck) und antivesikulärer Glutamattransporter 2 vom Kaninchen (1:500; AF860, Frontier Institute). Die folgenden sekundären Antikörper wurden verwendet (Wirtsspezies, Esel): Anti-Huhn DyLight 405 (1:250; 703-475-155, Jackson ImmunoResearch), Anti-Huhn Alexa Fluor 488 (1:500; 703-545-155, Jackson). ImmunoResearch), Anti-Ziege Alexa Fluor 405 (1:500; ab175665, Abcam), Anti-Ziege Alexa Fluor 488 (1:500; ab150129, Abcam), Anti-Ziege Alexa Fluor 555 (1:500; A-21432, Thermo Fisher Scientific oder ab150130, Abcam), Anti-Maus Alexa Fluor 488 (1:500, ab150109, Abcam), Anti-Maus Alexa Fluor 555 (1:500; ab150106, Abcam), Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (1: 500; A-21206, Thermo Fisher Scientific oder ab150073, Abcam) und Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:500; ab150074, Abcam).

Für die Zellkartierung und -zählung im Mittelhirn wurden koronale Schnitte 8,0 mm kaudal vom Bregma untersucht. Die rostrokaudalen Ebenen der Schnitte wurden anhand geeigneter Orientierungspunkte wie dem zerebralen Aquädukt, dem periaquäduktalen Grau, den sensorischen Wurzeln des Trigeminusnervs, dem oberen Kleinhirnstiel sowie den oberen und unteren Kollikuluskernen validiert. Die Verteilung CTb-markierter Zellen im Mittelhirn wurde bei acht Ratten untersucht. Bei drei der acht Ratten wurde auch die Verteilung der ChAT-immunreaktiven Zellen untersucht. CTb-markierte und ChAT-immunreaktive Zellen wurden auf digitale Bilder von Originalschnitten abgebildet, bevor sie in Standardschnitte von Paxinos und Watson62 transkribiert wurden, wiederum unter Verwendung der entsprechenden Orientierungspunkte.

Um die Anzahl der Fos-immunreaktiven Zellen in GFP- oder ChAT-immunreaktiven Populationen im MLR zu zählen, wurde ein Schnitt pro Ratte zufällig aus 2–4 aufeinanderfolgenden Schnitten ausgewählt. Die immunreaktiven Zellen wurden wie oben beschrieben auf digitale Bilder der ursprünglichen koronalen Schnitte abgebildet. Die Anzahl der kartierten Zellen in CnF und PPTg, deren Ausmaß gemäß dem Rattenhirnatlas62 und unter Bezugnahme auf die Verteilung von ChAT-immunreaktiven Zellen sowie geeigneten Orientierungspunkten definiert wurde, wurde doppelblind gezählt .

Die in den Abbildungen verwendeten Gehirnschnittbilder (Abb. 1a, c, e, i, 2a, e, 3a, 4a, 5a, ergänzende Abb. 2a, 6a, 7a, 10) wurden unter Bezugnahme auf die Abbildungen bei Paxinos und Watson erstellt Atlas des Rattenhirns62.

Während der optogenetischen In-vivo-Experimente wurden alle analogen Messungen über das AD-Wandler-Datenerfassungssystem (PowerLab 8/30 oder 8/35; ADInstruments) digitalisiert, kontinuierlich auf einem Computermonitor angezeigt und mit einer Abtastrate von 1 kHz auf einem digital aufgezeichnet Festplatte mit der LabChart-Software (v8.0 oder 8.1.16; ADInstruments). MAP und HR wurden post-hoc von Schlag zu Schlag berechnet und mit 1 kHz neu abgetastet. Die Draufsicht auf das Experiment mit Ratten bei Bewusstsein wurde kontinuierlich mit einer an einen Computer angeschlossenen HD-Webkamera (C920; Logicool) per Video aufgenommen und die Videodaten wurden mit einer Rate von 10 Bildern pro Sekunde (fps) gespeichert.

In optogenetischen Experimenten, die an anästhesierten oder enthirnten Ratten durchgeführt wurden, wurden Ausgangswerte aus Durchschnittswerten für 15, 30 oder 60 Sekunden vor optogenetischen Eingriffen ermittelt. Zur Untersuchung der RSNA- und VRNA-Reaktionen auf die Photostimulation wurden auch Durchschnittswerte für 1 s unmittelbar vor jeder kurzen Periode (0,5 s) der Photostimulationsperiode während des 1-minütigen intermittierenden Stimulationsprotokolls ermittelt. In Experimenten zur Untersuchung der Auswirkungen der optogenetischen Stimulation über die ChR2-Aktivierung bei wachen Ratten wurden Ausgangswerte aus 15-s-Durchschnittswerten vor Beginn der Laserbeleuchtung ermittelt. In Experimenten zur Untersuchung der Wirkung der optogenetischen Hemmung durch iChloC-Aktivierung bei wachen Ratten wurden Mittelwerte während des 2-s-Zeitraums unmittelbar vor der Laserbestrahlung als Basislinie bestimmt. Die Ausgangswerte sind in den Ergänzungstabellen 1–14 dargestellt.

Um die RSNA- und VRNA-Reaktionen auf Photostimulation zu quantifizieren, wurde nach Erhalt vollwellengleichgerichteter Signale dieser peripheren Nervenaktivitäten sowie Hintergrundrauschsignalen die Rauschkomponente für RSNA oder VRNA vom gleichgerichteten Signal abgezogen. RSNA- und VRNA-Reaktionen auf optogenetische Eingriffe wurden als relative Veränderungen gegenüber den Ausgangswerten quantifiziert, die als 100 % angegeben wurden. Zusätzliche Verfahren, z. B. Überlagerungs- und Mittelungsanalyse, wurden durchgeführt, um RSNA und VRNA als Reaktion auf eine Photostimulationsperiode von 0,5 Sekunden während eines intermittierenden Stimulationsprotokolls von 1 Minute zu quantifizieren. Relative Änderungen in RSNA oder VRNA gegenüber der Grundlinie wurden als Reaktion auf jede Periode einer 0,5-sekündigen Photostimulation mit 1 kHz erneut abgetastet, bevor sie einander überlagert und zum jeweiligen Zeitpunkt gemittelt wurden (Abb. 2c). Die AUC-Werte der gemittelten RSNA-Änderungen wurden auch als Index der RSNA-Reaktionen auf Photostimulation berechnet, indem die Anstiege der RSNA-Änderungen gegenüber dem Ausgangswert während des Zeitraums nach der Überlagerungs- und Mittelungsanalyse integriert wurden (Abb. 2c).

Während Experimenten zur Untersuchung der Wirkung der optogenetischen Stimulation bei Ratten bei Bewusstsein wurden Videos mit 10 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Diese wurden analysiert, um die Bewegungsgeschwindigkeit mithilfe eines Video-Tracking-Systems gemäß dem Handbuch (SMART Version 3.0; Panlab) zu berechnen. Um die Kontur der Ratte in jedem Bild einer Videosequenz zu bestimmen, wurde ein Bild des Versuchsbereichs (kreisförmige Spur) ohne Ratte als Referenz verwendet und mit einem der Videobilder während des Experiments verglichen, in denen die Ratte enthalten war. Der Unterschied zwischen beiden Bildern wurde dann vom System erkannt. Durch die aufeinanderfolgende Erkennung des Massenschwerpunkts der Ratte in jedem Bild konnte die Bewegung über 200 ms verfolgt werden. Anschließend wurde die momentane Rattengeschwindigkeit in der Kreisbahn ohne Glättung berechnet. Videos, die während Experimenten zur Untersuchung der Wirkung der optogenetischen Hemmung bei Ratten bei Bewusstsein aufgenommen wurden, wurden zur Validierung der mit der oben beschriebenen Methode berechneten WRR-Werte verwendet.

Daten wurden aus den Ergebnissen ausgeschlossen, wenn die Injektionen den Zielbereich verfehlten, die Spitzen der optischen Fasern nicht richtig positioniert waren, die Telemetriesignale während der optogenetischen Stimulation länger als 1 s unterbrochen wurden oder die Ratten nicht bereit waren, freiwillig auf dem Rad zu laufen.

Alle Messungen wurden in Excel (Microsoft) exportiert. Alle statistischen Analysen wurden in SigmaPlot 14.0 (Systat Software, Inc) durchgeführt. Für Vergleiche zwischen unabhängigen Gruppen wurden die Daten mit dem Welch-t-Test analysiert, wenn sie normalverteilt waren (bewertet mit dem Shapiro-Wilk-Test), oder mit einem Mann-Whitney-U-Test, wenn sie nicht normalverteilt waren. Für gepaarte Stichproben zwischen Versuchen wurden die Daten durch gepaarte t-Tests analysiert. Für wiederholte Stichproben zwischen Versuchen oder Zeitverlaufsänderungen wurden die Daten durch eine einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen (RM-ANOVA) oder durch eine einfaktorielle RM-ANOVA nach Friedman nach Rang analysiert, wobei Normalitätsannahmen (Shapiro-Wilk-Test) und/oder gleiche Varianz ( Brown-Forsythe-Test) wurden in der ANOVA nicht erfüllt. Für wiederholte Proben zwischen Versuchen zwischen unabhängigen Gruppen wurden die Daten mittels zweifaktorieller RM-ANOVA analysiert. Gegebenenfalls folgten auf diese ANOVA-Verfahren Dunnett-, Holm-Sidak- oder Tukey-Post-hoc-Tests. Alle Tests waren zweiseitig. Tests zur Darstellung jedes Diagramms in Zahlen und andere statistische Informationen, einschließlich statistischer F/t/χ2-Werte und Freiheitsgrade, sind in der Ergänzungstabelle 15 aufgeführt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Daten werden als Mittelwerte mit Standardfehlern (SEMs) ausgedrückt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle mit dieser Studie verbundenen Daten werden in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der gesamte Code zur Analyse sympathischer und kardiovaskulärer Reaktionen ist auf OSF verfügbar: https://osf.io/tuhgm/.

Johansson, J. E. Uber die Einwirkung der Muskelthatigkeit auf die Athmung und die Herzthatigkeit. Scand. Arch. Physiol. 5, 20–66 (1893).

Artikel Google Scholar

Krogh, A. & Lindhard, J. Die Regulierung von Atmung und Kreislauf während der Anfangsphasen der Muskelarbeit. J. Physiol. 47, 112–136 (1913).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waldrop, TG, Eldridge, FL, Iwamoto, GA & Mitchell, JH Zentrale neuronale Kontrolle von Atmung und Kreislauf während des Trainings. Handbuch der Physiologie. Übung: Regulierung und Integration mehrerer Systeme. 12.9, 333–380 (American Physiological Society, 1996).

Goodwin, GM, McCloskey, DI & Mitchell, JH Herz-Kreislauf- und Atemreaktionen auf Änderungen der zentralen Befehlsgewalt während isometrischer Übungen bei konstanter Muskelspannung. J. Physiol. 226, 173–190 (1972).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eldridge, FL, Millhorn, DE & Waldrop, TG Übungshyperpnoe und Fortbewegung: parallele Aktivierung durch den Hypothalamus. Science 211.4484, 844–846 (1981).

Artikel Google Scholar

Asmussen, E., Johansen, SH, Jørgensen, M. & Nielsen, M. Über die Nervenfaktoren, die Atmung und Kreislauf während des Trainings steuern. Acta Physiol. Scan. 63, 343–350 (1965).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gandevia, SC et al. Atemempfindungen, Herz-Kreislauf-Kontrolle, Kinästhesie und transkranielle Stimulation bei Lähmungen beim Menschen. J. Physiol. 470, 85–107 (1993).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iwamoto, GA et al. Identifizierung von kardiorespiratorischen Bereichen des Zwischenhirns und des Hirnstamms, die während des Trainings aktiviert werden. Gehirn Res. 726, 109–122 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kumada, N., Koba, S., Hanai, E. & Watanabe, T. Verteilung von Fos-immunreaktiven Zellen im ventralen Teil des Rattenmarks nach freiwilliger Laufbandübung. Auton. Neurosci. 208, 80–87 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Critchley, HD et al. Zerebrale Korrelate der autonomen kardiovaskulären Erregung: eine funktionelle Neuroimaging-Untersuchung beim Menschen. J. Physiol. 523, 259–270 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Green, AL et al. Identifizierung kardiorespiratorischer Neuroschaltkreise, die an der zentralen Steuerung während körperlicher Betätigung beim Menschen beteiligt sind. J. Physiol. 578, 605–612 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sander, M., Macefield, VG & Henderson, LA Kortikale und Hirnstammveränderungen der neuronalen Aktivität während des statischen Handgriffs und der Ischämie nach dem Training beim Menschen. J. Appl. Physiol. 108, 1691–1700 (2010).

Artikel PubMed Google Scholar

Eldridge, FL, Millhorn, DE, Kiley, JP & Waldrop, TG Stimulation durch zentrale Steuerung von Fortbewegung, Atmung und Kreislauf während des Trainings. Atmung. Physiol. 59, 313–337 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hilton, SM & Redfern, WS Eine Suche nach Hirnstammzellgruppen, die die Abwehrreaktion bei der Ratte integrieren. J. Physiol. 378, 213–228 (1986).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bedford, TG, Loi, PK & Crandall, CC Ein Modell dynamischer Übungen: die Vorbereitung des Bewegungsapparats der enthirnten Ratte. J. Appl. Physiol. 72, 121–127 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Silber, DH, Sinoway, LI, Leuenberger, UA & Amassian, VE Die magnetische Stimulation des menschlichen motorischen Kortex ruft die Aktivität sympathischer Nerven der Haut hervor. J. Appl. Physiol. 88, 126–134 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thornton, JM, Aziz, T., Schlugman, D. & Paterson, DJ Elektrische Stimulation des Mittelhirns erhöht die Herzfrequenz und den arteriellen Blutdruck bei wachen Menschen. J. Physiol. 539, 615–621 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Green, AL et al. Durch tiefe Hirnstimulation kann der arterielle Blutdruck bei wachen Menschen reguliert werden. Neuroreport 16, 1741–1745 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Paterson, DJ Definiert die Neuroschaltkreise der Belastungshyperpnoe. J. Physiol. 592, 433–444 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Del Buono, MG et al. Belastungsunverträglichkeit bei Patienten mit Herzinsuffizienz: JACC-Bericht zum neuesten Stand der Technik. Marmelade. Slg. Cardiol. 73, 2209–2225 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Koba, S., Hisatome, I. & Watanabe, T. Die Funktionsstörung zentraler Befehle bei Ratten mit Herzinsuffizienz wird durch oxidativen Stress im Gehirn vermittelt und durch körperliches Training normalisiert. J. Physiol. 592, 3917–3931 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Doehner, W. et al. Herz-Gehirn-Interaktion bei Patienten mit Herzinsuffizienz: Überblick und Vorschlag für eine Taxonomie. Ein Positionspapier der Study Group on Heart and Brain Interaction der Heart Failure Association. EUR. J. Herzinsuffizienz. 20, 199–215 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Downing, J. & Balady, GJ Die Rolle des körperlichen Trainings bei Herzinsuffizienz. Marmelade. Slg. Cardiol. 58, 561–569 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Jansen, AS et al. Zentrale Befehlsneuronen des sympathischen Nervensystems: Grundlage der Kampf-oder-Flucht-Reaktion. Science 270, 644–646 (1995).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Ross, CA et al. Tonische vasomotorische Kontrolle durch das rostrale ventrolaterale Mark: Wirkung der elektrischen oder chemischen Stimulation des Bereichs, der C1-Adrenalinneuronen enthält, auf den arteriellen Druck, die Herzfrequenz sowie die Plasma-Katecholamine und das Vasopressin. J. Neurosci. 4, 474–494 (1984).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown, DL & Guyenet, PG Elektrophysiologische Untersuchung kardiovaskulärer Neuronen im rostralen ventrolateralen Mark bei Ratten. Zirkel. Res. 56, 359–369 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schreihofer, AM, Stornetta, RL & Guyenet, PG Regulierung des sympathischen Tonus und des arteriellen Drucks durch das rostrale ventrolaterale Mark nach Erschöpfung der C1-Zellen bei Ratten. J. Physiol. 529, 221–236 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abbott, SB et al. Die Photostimulation von Channelrhodopsin-2 exprimierenden ventrolateralen Markneuronen erhöht die sympathische Nervenaktivität und den Blutdruck bei Ratten. J. Physiol. 587, 5613–5631 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dampney, RA Zentrale Mechanismen zur Regulierung der koordinierten Herz-Kreislauf- und Atmungsfunktion bei Stress und Erregung. Bin. J. Physiol. Regul. Integr. Komp. Physiol. 309, R429–R443 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shik, ML & Orlovsky, GN Neurophysiologie des Bewegungsautomatismus. Physiol. Rev. 56, 465–501 (1976).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ryczko, D. & Dubuc, R. Die multifunktionale mesenzephale Bewegungsregion. Curr. Pharm. Des. 19, 4448–4470 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Garcia-Rill, E. & Skinner, RD Die mesenzephale Bewegungsregion. I. Aktivierung einer Markprojektionsstelle. Gehirn Res. 411, 1–12 (1987).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roseberry, TK et al. Zelltypspezifische Steuerung der Bewegungskreisläufe des Hirnstamms durch Basalganglien. Zelle 164, 526–537 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brailoiu, GC, Dun, SL & Dun, NJ Immunreaktivität der Glutamatrezeptor-Untereinheit in Neuronen des rostralen ventrolateralen Marks der Ratte. Auton. Neurosci. 98, 55–58 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Capelli, P., Pivetta, C., Soledad Esposito, M. & Arber, S. Schaltkreise zur Steuerung der Bewegungsgeschwindigkeit im kaudalen Hirnstamm. Natur 551, 373–377 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Caggiano, V. et al. Schaltkreise im Mittelhirn, die die Geschwindigkeit des Bewegungsapparates und die Gangwahl bestimmen. Natur 553, 455–460 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Josset, N. et al. Deutliche Beiträge der Kerne der mesenzephalen Bewegungsregion zur Bewegungskontrolle bei der sich frei bewegenden Maus. Curr. Biol. 28, 884–901.e3 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Strack, AM, Sawyer, WB, Marubio, LM & Loewy, AD Spinaler Ursprung sympathischer präganglionärer Neuronen bei der Ratte. Gehirn Res. 455, 187–191 (1988).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Motekaitis, AM & Kaufman, MP Die Stimulation der mesenzephalen Bewegungsregion verengt die Atemwege von Katzen. Einatmen. Physiol. 106, 263–271 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mitchell, JH, Kaufman, MP & Iwamoto, GA Der Belastungsdruckreflex: seine kardiovaskulären Wirkungen, afferenten Mechanismen und zentralen Bahnen. Annu. Rev. Physiol. 45, 229–242 (1983).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, AM et al. Identifizierung eines Schaltkreises im Hirnstamm, der den visuellen kortikalen Zustand parallel zur Fortbewegung reguliert. Neuron 83, 455–466 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koba, S. et al. Sympathoerregung durch hypothalamische paraventrikuläre Kernneuronen, die zum rostralen ventrolateralen Mark projizieren. J. Physiol. 596, 4581–4595 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kataoka, N., Shima, Y., Nakajima, K. & Nakamura, K. Ein zentraler Haupttreiber psychosozialer Stressreaktionen bei Ratten. Science 367, 1105–1112 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Cannon, WB Organisation für die physiologische Homöostase. Physiol. Rev. 9, 399–431 (1929).

Artikel Google Scholar

Swanson, LW & Mogenson, GJ Neuronale Mechanismen für die funktionelle Kopplung autonomer, endokriner und somatomotorischer Reaktionen im adaptiven Verhalten. Brain Res 228, 1–34 (1981).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miki, K. & Yoshimoto, M. Sympathische Nervenaktivität während Schlaf, Bewegung und psychischem Stress. Auton. Neurosci. 174, 15–20 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Barman, SM & Yates, BJ Entschlüsselung der neuronalen Kontrolle der sympathischen Nervenaktivität: Statusbericht und Anweisungen für zukünftige Forschung. Vorderseite. Neurosci. 11, 730 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kerman, IA, Enquist, LW, Watson, SJ & Yates, BJ Hirnstammsubstrate sympathomotorischer Schaltkreise, identifiziert durch transsynaptisches Tracing mit Pseudorabiesvirus-Rekombinanten. J. Neurosci. 23, 4657–4666 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krout, KE, Mettenleiter, TC & Loewy, AD Einzelne ZNS-Neuronen verbinden sowohl das zentrale motorische als auch das kardiosympathische System: eine Doppelvirus-Tracing-Studie. Neurowissenschaften 118, 853–866 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kerman, IA, Akil, H. & Watson, SJ Rostrale Elemente sympathomotorischer Schaltkreise: eine viral vermittelte transsynaptische Tracing-Studie. J. Neurosci. 26, 3423–3433 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bachelard, H., Gardiner, SM & Bennett, T. Herz-Kreislauf-Reaktionen, hervorgerufen durch chemische Stimulation des rostralen ventrolateralen Marks bei bewussten, ungebremsten Ratten. J. Auton. Nerv. Syst. 31, 185–190 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abbott, SB et al. Die selektive optogenetische Aktivierung rostraler ventrolateraler medullärer katecholaminerger Neuronen führt bei wachen Mäusen zu einer kardiorespiratorischen Stimulation. J. Neurosci. 33, 3164–3177 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roseberry, TK, Lalive, AL, Margolin, BD & Kreitzer, AC Unterdrückung des Bewegungsapparates durch einen monosynaptischen Schaltkreis zwischen Amygdala und Hirnstamm. bioRxiv https://doi.org/10.1101/724252 (2019).

Han, W. et al. Integrierte Kontrolle der Raubtierjagd durch den zentralen Kern der Amygdala. Zelle 168, 311–324.e18 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakurai, T. Die Rolle von Orexin bei motiviertem Verhalten. Nat. Rev. Neurosci. 15, 719–731 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, H. et al. Die Subkerne des Nucleus accumbens regulieren motiviertes Verhalten durch direkte Hemmung und Enthemmung von VTA-Dopamin-Subpopulationen. Neuron 97, 434–449.e4 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takakusaki, K. et al. Orexinerge Projektionen auf das Mittelhirn der Katze vermitteln den Wechsel emotionaler Verhaltenszustände von Fortbewegung zu Kataplexie. J. Physiol. 568, 1003–1020 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williamson, JW Autonome Reaktionen auf Übungen: Wo ist das zentrale Kommando? Auton. Neurosci. 188, 3–4 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kataoka, N., Hioki, H., Kaneko, T. & Nakamura, K. Psychischer Stress aktiviert einen dorsomedialen Hypothalamus-Mark-Raphe-Kreislauf, der die Thermogenese und Hyperthermie des braunen Fettgewebes antreibt. Zellmetabolismus 20, 346–358 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Takahashi, M., et al. Bei der Erkennung von Rezeptoren und Ionenkanälen im Gehirn. Neuromethods (Hrsg. Lujan R. & Ciruela F.) Bd. 169, 323–341 (Humana, 2021).

Koba, S., Gao, Z. & Sinoway, LI Oxidativer Stress und der Muskelreflex bei Herzinsuffizienz. J. Physiol. 587, 5227–5237 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paxinos G & Watson C. Das Rattenhirn in stereotaktischen Koordinaten 6. Aufl. (Academic Press/Elsevier, 2007).

Referenzen herunterladen

Diese Forschung wurde durch einen JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (21H03321) (SK) unterstützt; ein JSPS KAKENHI-Stipendium für wissenschaftliche Forschung (B) (18H03151) (SK); ein JSPS KAKENHI-Stipendium für junge Wissenschaftler (A) (15H05367) (SK); ein JSPS KAKENHI-Stipendium für anspruchsvolle Forschung (Exploratory) (20K21759) (SK); ein JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (22K06470) (N.Ka.); ein JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K06954) (N.Ka.); ein JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03418) (KN); von AMED (JP21wm0525002 an N.Ka.; JP21gm5010002 an KN); von JST Moonshot R&D (JPMJMS2023 bis KN); und Zuschüsse der Takeda Science Foundation (SK). Wir danken Yui Yamane, Koji Maruyama, Atsuki Otake, Yumi Ono und Eri Hanai für ihre Unterstützung bei Experimenten und der doppelblinden manuellen Zellzählung sowie dem von der Präfektur Tottori, Japan, verwalteten Tottori Bio Frontier für die Nutzung der konfokalen Mikroskopie System.

Abteilung für Integrative Physiologie, Medizinische Fakultät der Tottori-Universität, Yonago, Japan

Satoshi Koba, Nao Kumada, Emi Narai und Tatsuo Watanabe

Abteilung für Integrative Biowissenschaften, Tottori University Graduate School of Medical Sciences, Yonago, Japan

Kumada auch

Abteilung für Integrative Physiologie, Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Naoya Kataoka und Kazuhiro Nakamura

Nagoya University Institute for Advanced Research, Nagoya, Japan

Naoya Kataoka

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

SK hat die Studie konzipiert. SK und N.Ku entwarfen Experimente mit Input von N.Ka. und KNSK, N.Ka., KN und TW haben Lernmaterialien vorbereitet. N.Ku. und SK führten Experimente durch und analysierten Daten. SK, N.Ku. und EN vorbereitete Zahlen. SK, N.Ku. und KN diskutierten Daten. SK und KN haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Co-Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Satoshi Koba.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Koba, S., Kumada, N., Narai, E. et al. Ein monosynaptischer Erregungsweg im Hirnstamm, der Bewegungsaktivitäten und sympathische Herz-Kreislauf-Reaktionen steuert. Nat Commun 13, 5079 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

Zitat herunterladen

Eingegangen: 10. September 2021

Angenommen: 18. August 2022

Veröffentlicht: 29. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Klinische autonome Forschung (2022)

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.