Nachweis von HOCl | Nanchang MPO MPT Inc.

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 10329 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Künstliche Biomaterialien können die Geschwindigkeit der Geweberegeneration deutlich steigern. Allerdings führt die Implantation von Gerüsten nicht nur zu einer beschleunigten Gewebeheilung, sondern auch zu einer Immunantwort des Organismus, die einen Abbau des Biomaterials zur Folge hat. Die Synergie der Immunantwort und der Gerüstabbauprozesse bestimmt maßgeblich die Effizienz der Geweberegeneration. Dennoch besteht ein großer Bedarf an Methoden, die zur schnellen, genauen und nicht-invasiven Charakterisierung des Abbaugrades von Biomaterial geeignet sind. Hier zeigen wir die Möglichkeit, den Abbau dezellularisierter boviner Perikardgerüste unter Bedingungen zu überwachen, die die Immunantwort und Oxidationsprozesse nachahmen, indem wir Multiphotonentomographie in Kombination mit Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (MPT-FLIM) verwenden. Wir fanden heraus, dass die Fluoreszenzlebensdauer von Genipin-induzierten Vernetzungen in Kollagen und Oxidationsprodukten von Kollagen wichtige Marker für den oxidativen Abbau von Gerüsten sind. Dies wurde in Modellversuchen verifiziert, bei denen die Oxidation mit hypochloriger Säure oder durch Exposition gegenüber aktivierten Neutrophilen induziert wurde. Die Parameter des Fluoreszenzabfalls korrelierten auch mit den Veränderungen der mikromechanischen Eigenschaften der Gerüste, die mithilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) ermittelt wurden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass FLIM für quantitative Bewertungen der Eigenschaften und des Abbaus der Gerüste verwendet werden kann, die für die Wundheilungsprozesse in vivo wesentlich sind.

Im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin stellen Gerüste mechanische Unterstützung und biochemische Signale bereit, um das Überleben und die Differenzierung der Zellen sicherzustellen1. Die Dezellularisierung tierischer Gewebe und Organe ermöglicht die Herstellung einer extrazellulären Matrix (ECM), die die mechanischen und biochemischen Eigenschaften der nativen ECM beibehält und eine ideale Nische für die Geweberegeneration darstellt2,3. Das Biomaterial stimuliert die Zellrekrutierung und den Gewebeumbau und wird gleichzeitig allmählich abgebaut. Die Geschwindigkeit und die Mechanismen des Gerüstabbaus bestimmen weitgehend die Immunantwort auf die Gerüstimplantation und die Effizienz der Wundheilung.

Dezellularisiertes Rinderperikard (DBP) ist aufgrund seiner Verfügbarkeit, Biokompatibilität und einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften für die Medizin von besonderem Interesse4. DBP ist ein kostengünstiges und robustes Material, das häufig in der Herzchirurgie, Orthopädie, Allgemein- und Lungenchirurgie sowie Zahnmedizin eingesetzt wird5. Die Vernetzung von DBP durch chemische Wirkstoffe wie Glutaraldehyd, Epoxidverbindungen und Genipin moduliert die Immunogenität des Biomaterials, verbessert seine proteolytische Stabilität und verlängert seinen Abbau4,6. Eine übermäßige Verzögerung des Gerüstabbaus kann jedoch zu einer übermäßigen Entzündungsreaktion und der Bildung von Fremdkörpern führen. Daher ist das Design der neuen Vernetzungsmittel und die Optimierung der Gerüstarchitektur und des Gerüstabbaus ein Hotspot in der regenerativen Medizin7.

Die Implantation von Gerüsten löst die Immunantwort aus, wobei Neutrophile die ersten Immunzellen sind, die an der Stelle der Gewebeschädigung rekrutiert und aktiviert werden8,9. Die Aktivierung von Neutrophilen geht mit der Sekretion von Proteinen (z. B. Kollagenase, Gelatinase) aus intrazellulären Granula einher, die in der Lage sind, die Biomaterialien abzubauen. Darüber hinaus setzen aktivierte Neutrophile Myeloperoxidase (MPO) frei, die – in Gegenwart von H2O2 – hypochlorige Säure (HOCl) erzeugt. HOCl ist ein starkes Oxidationsmittel, das nicht nur biologische Moleküle, sondern auch kohlenstoffbasierte Nanomaterialien oxidieren und abbauen kann10,11,12.

Physikalische Techniken wie die Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurden erfolgreich eingesetzt, um die Veränderungen der Struktureigenschaften und den Abbau von Gerüsten zu bewerten13,14,15,16. Optische Methoden ermöglichen außerdem eine schnelle quantitative Beurteilung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Biomaterialien sowie die Untersuchung des Stoffwechselstatus der umgebenden Zellen. Besonders vielversprechend ist die Anwendung der Multiphotonen-Fluoreszenztomographie in Kombination mit der Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (MPT-FLIM), die es ermöglicht, tiefere Gewebeschichten mit molekularspezifischem Kontrast darzustellen17. Das MPT-FLIM wurde zuvor zur Charakterisierung des Abbaus von Gerüsten auf Kollagenbasis verwendet18,19,20,21,22,23. FLIM kombiniert mit Raman-Spektroskopie ermöglicht auch die Beurteilung des Vernetzungsgrades in kollagenhaltigen Perikardgerüsten anhand des Fluoreszenzsignals der Genipin-induzierten Vernetzungen19. Multispektrales FLIM wurde verwendet, um den enzymatischen Kollagenabbau in Rinder-Perikardgerüsten zu überwachen20. Fluoreszenz-Stereomikroskopie und Multiphotonen-Tomographie wurden in Verbindung mit immunhistochemischen Tests und Mikrotomographie verwendet, um Einblicke in den Abbau von DBP ex vivo zu gewinnen21. Das faseroptische FLIM wurde zur Verfolgung der Dynamik der Rezellularisierung der Gerüstoberfläche durch Überwachung der Änderungen der Fluoreszenzlebensdauer22 eingesetzt. Parameter der Autofluoreszenzlebensdauer von Kollagenoxidationsprodukten und Vernetzungen können auch zur Charakterisierung natürlicher Kollagene und ihres Abbaus in vivo24,25,26,27 verwendet werden. Die durch die Immunzellen induzierte Veränderung der Kollagen-Biomaterialien wurde jedoch nicht mit optischen Techniken untersucht.

In dieser Arbeit untersuchten wir die analytische Leistungsfähigkeit des MPT-FLIM bei der Bewertung des Abbaus von DBP-Gerüsten, der durch die Simulation der durch Neutrophile induzierten Oxidation verursacht wird. Als Testobjekte dienten die mit zwei Vernetzern, Genipin und Ethylenglykoldiglycidylether (EGDE), behandelten DBP-Gerüste.

Wir haben gezeigt, dass der HOCl-gesteuerte Abbau von Perikardgerüsten mithilfe der Fluoreszenzlebensdauerreaktion der Genipin-induzierten Vernetzungen und der Autofluoreszenz der Oxidationsprodukte der Gerüstproteine überwacht werden kann. Die beobachteten Fluoreszenzabklingparameter korrelierten mit den mittels AFM gemessenen mikromechanischen Eigenschaften der Gerüste. Der entwickelte fluoreszenzbasierte Ansatz wurde mithilfe des Gerüstabbaus unter Bedingungen getestet, die eine Immunantwort menschlicher Neutrophilen simulieren. Unsere Ergebnisse bestätigen, dass die Fluoreszenzzerfallsparameter empfindliche Marker für die Überwachung des Abbaus biologischer Gerüste und der durch die Gerüste hervorgerufenen Immunreaktionen sind.

DBP wurde wie zuvor beschrieben4 hergestellt und mit Gammastrahlung sterilisiert. Proben des Gerüsts für die NaOCl-Behandlung wurden unter sterilen Bedingungen hergestellt. DBP-Stücke mit einem Gewicht von 10–18 mg wurden einen Tag lang in Wasser gelegt (10 ml Wasser wurden zweimal gewechselt) und dann 2–3 Stunden lang in 10 ml PBS. Abschließend wurden die Proben in PBS mit 50 mM Na-Phosphat-Puffer (pH 7,3–7,4) gegeben und mit Hypochlorit behandelt. Kontrollproben (ohne Behandlung) wurden zwei Tage vor den Messungen auf die gleiche Weise hergestellt und bei 4–6 °C aufbewahrt.

NaOCl wurde von SigmaAldrich Co. als Lösung von 10–15 % Chlor und NaOH in Wasser gekauft (#425044). Die Konzentration von NaOCl in der Stammlösung wurde durch Messung der Absorption bei 290 nm (ε = 350 M−1 cm−1) nach aufeinanderfolgenden Verdünnungen des Reagenzes in 5 mM NaOH bestimmt. Die Konzentration betrug 1,7 M. Mikroaliquoten von 0,4–1 µl NaOCl wurden dem Gerüst in 4 ml Puffer (PBS + 50 mM NaH2PO4, pH 7,3–7,4) zugesetzt, um die Endkonzentration von 170–425 µM NaOCl zu erreichen . Abhängig vom gewünschten Grad der DBP-Modifikation wurde 5–10 Tage lang ein- oder zweimal täglich NaOCl zugegeben. Die größte Menge an zugesetztem Hypochlorit überschritt nicht 15 μl, während sich der pH-Wert der Lösung um nicht mehr als 0,15 Einheiten änderte. Eine Zugabe von NaOCl erfolgte, wenn die NaOCl-Konzentration in einer Probe 50 μM nicht überstieg. Die Restmenge an Hypochlorit wurde mit der auf der Oxidation von 5-Thio-2-nitrobenzoesäure TNB28 basierenden Methode bestimmt. Die Gesamtmenge an zugesetztem NaOCl wurde als µmol NaOCl pro mg Gerüst quantifiziert. Am Ende der Inkubation wurden die Proben für mehrere Stunden in Wasser für FLIM oder in PBS für AFM-Messungen gegeben (7–8 ml wurden zweimal gewechselt).

Gemäß den vom Gesundheitsministerium der Russischen Föderation genehmigten Protokollen wurde frisches venöses Blut von gesunden Spendern in Blue-Top-Vakutainern mit 3,8 % Natriumcitrat als Antikoagulans gesammelt. Menschliche Neutrophile wurden durch ein Verfahren unter Verwendung von Histopaque 1.077 (Sigma, St. Louis, MO, USA) isoliert, wie in29 beschrieben. Menschliches Blut wurde mit 6 % Dextran T-500 (Sigma, St. Louis, MO, USA) in PBS im Verhältnis 5:1 gemischt und die Erythrozyten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) sedimentieren gelassen. Das leukozytenreiche Plasma wurde auf 3 ml Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, USA) geschichtet und einer Zentrifugation (400 g, 30 min, RT) unterzogen. Kontaminierende Erythrozyten wurden durch hypotone Lyse mit kaltem H2O entfernt. Neutrophile wurden zweimal mit PBS (4 °C) gewaschen; Die erhaltenen Zellen wurden in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca2+, Mg2+ und mit 5 % autologem Serum in einer Konzentration von 10–12 Millionen Zellen pro ml suspendiert und vor der Verwendung bei 4 °C gelagert. Die Zellsuspension wurde für zwei aufeinanderfolgende Inkubationen verdünnt. Neutrophile wurden zweimal täglich isoliert, daher wurden vier Inkubationen durchgeführt.

Mit Genipin vernetztes DBP (DBP-G) wurde wie oben beschrieben mit H2O und PBS behandelt. Eine 5×5 mm große DBP-G-Probe wurde in 0,7–0,8 ml Neutrophilensuspension gegeben, zu der Calcium (1 mM) und Magnesium (0,5 mM) hinzugefügt wurden. Eine Kontrollprobe des Gerüsts wurde in HBSS gegeben, das 5 % Serum, Ca2+ (1 mM) und Mg2+ (0,5 mM) enthielt, gefolgt von der Zugabe von 25–30 μl PBS (was dem Volumen der hinzugefügten Reagenzien entspricht). Proben mit Neutrophilen). Der Neutrophilenaktivator Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) wurde innerhalb von 15 Minuten in einer Konzentration von 150 nM zugegeben. 1,5 Stunden nach Beginn der Inkubation wurden 100 µM H2O2 dreimal (im Abstand von 30 Minuten) in einer Konzentration von 100 µM zugegeben. Die Proben wurden alle 30 oder 90 Minuten (letzte Inkubation) durch vorsichtiges Pipettieren gemischt. Drei Inkubationen wurden 3–3,5 Stunden lang bei 37 °C durchgeführt; Die vierte Inkubation wurde über Nacht (6–7 Stunden) bei RT durchgeführt. Zwischen den Inkubationen wurde das Gerüst dreimal mit PBS gewaschen. Am Ende der Inkubationen wurde das Gerüst innerhalb von 5–7 Minuten mit PBS und 0,2 % SDS gewaschen, um anhaftende Neutrophilenreste zu entfernen; Das Kontrollgerüst wurde auf die gleiche Weise behandelt. Schließlich wurden die Proben vor den FLIM-Messungen mehrere Stunden in Wasser gehalten.

Alle Spender hatten eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben. Die Ethikkommission der Ersten Moskauer Staatlichen Medizinischen Universität Sechenov hat ein positives Votum erhalten und die Experimente entsprachen den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki in der 2013 überarbeiteten Fassung und den vom Gesundheitsministerium der Russischen Föderation genehmigten Protokollen.

FLIM mit Multiphotonen-Anregung wurde mit einem speziell angefertigten multimodalen Multiphotonen-Mikroskopieaufbau durchgeführt. Als Anregungsquelle wurde der optische parametrische Femtosekundenoszillator TOPOL-1050-C (Avesta, Russland) verwendet, der eine Anregung im Bereich von 680–1000 nm liefert. Die Pulsbreite der anregenden Strahlung betrug ~150 fs; die Wiederholungsrate betrug 80 MHz, die durchschnittliche Leistung bei der Anregungswellenlänge auf der Probe betrug 1 mW. Das Scannen der Probe wurde mit dem Scankopf DSC-120 (Becker&Hickl, Deutschland) durchgeführt. Die Bildgebung erfolgte mit einem Luft-Plan-Apochromat-20-fach-Objektiv mit NA = 0,75. Fluoreszenzabklingkurven wurden mit dem Hybrid-GaAsP-Detektor HPM-100-40 (Becker & Hickl, Deutschland) mit einer Empfindlichkeit im Bereich von 250–720 nm und einer Instrumentenreaktionsfunktion mit einer Zeitbreite von 50 ps erfasst. Um das Anregungslicht abzuschneiden, wurde der dichroitische Kurzpassfilter mit 680 nm verwendet. Da die spektralen Eigenschaften des FLIM-Detektionssystems es nicht ermöglichten, das Signal der zweiten Harmonischen vollständig aus dem Kollagen von Gerüsten zu eliminieren, überprüfen wir zusätzlich das Fehlen ultraschneller Komponenteneigenschaften für das Signal der zweiten Harmonischen in den Abklingkurven beider DBP-G-Proben angeregt bei 800 nm und DBP-EGDE-Proben angeregt bei 730 nm. Eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.

Zur Auswahl des FLIM-Bildgebungsbereichs wurde Weißlicht-Weitfeldmikroskopie verwendet. Da die Proben eine homogene Struktur aufwiesen, gab es keine zusätzlichen Anforderungen an die Auswahl der Bildbereiche. Die Scantiefe wurde auf 10–20 μm von der Probenoberfläche eingestellt; In dieser Position hatte das Fluoreszenzsignal die maximale Amplitude.

Die Fluoreszenzabklingkurven wurden mit der Software SPCImage 8.3 (Becker & Hickl, Deutschland) nach räumlichem Binning angepasst (die Behältergröße betrug 3 für mit Genipin vernetzte DBP-Gerüste und 10 für die Verarbeitung von mit Ethylenglykoldiglycidylether vernetzten DBP-Gerüsten ) unter Verwendung des biexponentiellen Zerfallsmodells (Gl. 1):

Dabei ist \(I\left( t \right)\) das detektierte Fluoreszenzsignal, \(IRF\left( t \right)\) die Instrumentenreaktionsfunktion des Detektionssystems, a1,a2 die charakteristischen Amplituden, τ1 , τ2-charakteristische Lebensdauern des Fluoreszenzzerfalls, geschätzt aus der Anpassung. Die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer (τm) wurde als gewichtete Summe der Fluoreszenzlebensdauern τm = (a1τ1 + a2 τ2)/(a1 + a2) berechnet. Der Zeigerplot der Daten wurde gemäß Digman et al.30 berechnet. Das Zeitfenster des Zeigerplots wurde mit T = 4 ns gewählt, d. h. die Frequenz des Zeigerplots war besser gleich Ω = 2 π/4 ns−1 Datendarstellung im Zeigerdiagramm.

Die Analyse der Verteilung der Fluoreszenzabklingparameter, die Berechnung von Zeigerdiagrammen und die Datenvisualisierung wurden mithilfe benutzerdefinierter Python 3-Skripte unter Verwendung der Bibliotheken NumPy, Pandas, Matplotlib und Scikit-Learn31 durchgeführt.

Um die beobachtete Bimodalität in den Verteilungen der mittleren Fluoreszenzlebensdauer τm, die für mit NaOCl behandelte DPB-G-Gerüste erhalten wurden, quantitativ abzuschätzen, wurden die Fluoreszenzlebensdauerverteilungen mithilfe des Gaußschen Mischungsmodells (scikit-learn Python-Bibliothek) angepasst. Die Verteilungen der mittleren Lebensdauer τm für einzelne Proben, die mit 0,1, 0,25 und 0,75 μmol (NaOCl)/mg (Gerüst) behandelt wurden, wurden als Mischung aus zwei Gaußschen Verteilungen mit unterschiedlichen Mittelwerten (τm(1), τm(2)) und angepasst Varianzparameter (σ(1), σ(2)), während die Verteilungen des τm-Parameters für die Kontrollprobe und die mit 1,5 μmol (NaOCl)/mg (Gerüst) behandelte Probe, die keine ausgeprägte Bimodalität aufwiesen, mit Single angepasst wurden Gaußsche Verteilung. Die Anteile des oxidierten Materials wurden als Summe der dem Cluster zugeordneten Pixel mit einer längeren Fluoreszenzlebensdauer, normiert auf die Gesamtzahl der Pixel in der Verteilung, geschätzt.

AFM-Experimente wurden mit einem Biscope Resolve AFM-System (Bruker, Santa Barbara, CA) durchgeführt, das auf einem inversen optischen Mikroskop Axio Observer (Carl Zeiss, Deutschland) montiert war. Es wurden ScanAsyst-Fluid-Cantilever (Bruker) mit einer nominellen Federkonstante von 0,7 N/m und einem nominellen Spitzenradius von 20 nm verwendet. Die genauen Werte wurden mit der Thermal-Tune-Methode bzw. durch Scannen der Titan-Rauheitsprobe (Bruker) ermittelt. Da DBP, wie die meisten biologischen Proben, eine erhebliche mechanische Heterogenität aufweist, wurde darauf geachtet, Kontroll- und behandelte Probenstücke von nahe gelegenen Stellen auf dem Quell-DBP zu erhalten. Die Proben für das AFM wurden in zwei Hälften geschnitten und mit den verschiedenen Seiten nach oben auf den Boden einer Petrischale geklebt, sodass beide Seiten der Probe zugänglich waren. Die Seite mit geringerer Rauheit und Heterogenität wurde für die weitere Analyse ausgewählt4. Alle AFM-Messungen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Kraftvolumenkartierung wurde über 10 × 10 µm große Bereiche mit 32 × 32 Kraftkurvenarrays durchgeführt; Es wurden 5–6 Karten pro Probe aufgezeichnet. Die vertikale Piezo-Bewegungsgeschwindigkeit betrug 61 µm/s und die Auslösekraft betrug ≈25 nN. Jede Kraftkurve wurde gemäß Efremov et al.32 um den hydrodynamischen Widerstand korrigiert und analysiert, um mithilfe des Hertz-Modells (Gleichung 2) den Young-Modulwert zu ermitteln:

Dabei ist F die gemessene Kraft, E der Elastizitätsmodul, ν das Poisson-Verhältnis (angenommen 0,5), R der Spitzenradius und δ die Eindrucktiefe.

Die AFM-Bildgebung wurde unter den gleichen Bedingungen mit den gleichen Auslegern im Peak-Force-Tapping-Modus durchgeführt. 10 × 10 µm-Scans mit 256 × 256 Punkten wurden bei einer Oszillationsfrequenz von 1 kHz und einer Amplitude von 150 nm mit einem Sollwert von 2 nN erfasst. Die erfassten Topographiebilder wurden mit der Gwyddion-Software verarbeitet (abgeflacht)33.

Die Abbildungen stellen die Ergebnisse eines typischen Experiments aus drei unabhängigen Experimenten dar. Die Daten werden als Verteilungshistogramme oder Superplots34 angezeigt, sofern im Text nichts anderes angegeben ist.

DBP-G-Gerüste wurden mit NaOCl, einem Hauptprodukt der von Neutrophilen gesteuerten Immunantwort, behandelt und mit MPT-FLIM mit Anregung bei 800 nm und Emissionszerfallsdetektion im Bereich von 350–680 nm untersucht. Sowohl in Kontrollproben (unbehandelt) als auch in oxidierten (behandelten) Proben wurde eine intensive Fluoreszenzreaktion beobachtet, die durch das biexponentielle Zerfallsmodell gut beschrieben wird. Dem Fluoreszenzsignal wurden sowohl kurze als auch lange Abklingkomponenten zugeschrieben, da die charakteristischen Lebensdauern τ1 und τ2 der Abklingkomponenten deutlich größer waren als die instrumentelle Antwortfunktion, wodurch der Einfluss des von Kollagenfasern erzeugten Signals der zweiten Harmonischen ausgeschlossen wurde (eine detaillierte Beschreibung wird gegeben). in der Ergänzenden Anmerkung 1). Das Vorhandensein eines solch intensiven Fluoreszenzsignals kann durch die Bildung von Genipin-induzierten Vernetzungen im Kollagen erklärt werden35.

Abbildung 1A zeigt die Karten der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer τm für die Kontrollprobe und Proben, die mit unterschiedlichen NaOCl-Konzentrationen behandelt wurden. Die Fluoreszenzlebensdauer im Kontroll-DPB-G-Gerüst (Abb. 1A) war homogen über das Sichtfeld verteilt, während in den behandelten Gerüsten die Werte der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer heterogen über die Probe verteilt waren. Verteilungshistogramme der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer sind in Abb. 1B dargestellt. Für die Kontrollprobe wies die durchschnittliche Fluoreszenzabklingzeit eine enge unimodale Verteilung mit einem Medianwert von ~ 600 ps auf. Bei den behandelten Proben verschob sich die Verteilung der Medianwerte der Fluoreszenzlebensdauer nach Exposition gegenüber 0,1, 0,25, 0,75 bzw. 1,5 µmol NaOCl/mg Gerüst zu größeren Werten von ~680, 740, 840 ps und ~1350 ps.

Parameter des Fluoreszenzabfalls der dezellularisierten Rinder-Perikardgerüste, vernetzt mit Genipin (DBP-G), behandelt mit Natriumhypochlorit. (A) Karten der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer (τm) des Kontroll-DPB-G-Gerüsts und der DPB-G-Gerüste, behandelt mit 0,25, 0,75, 1,5 µmol (NaOCl)/mg (Gerüst). (B) Histogrammverteilungen der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer τm für DPB-G-Proben, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumhypochlorit behandelt wurden. Die experimentellen Fluoreszenzlebensdauerverteilungen wurden durch eine Gauß-Verteilung (Kontrollprobe und mit 1,5 μmol (NaOCl)/mg (Gerüst) behandelte Probe) oder durch eine Mischung aus zwei Gauß-Verteilungen angepasst. Blaue und rote gestrichelte Linien stellen die jeweiligen Komponenten in der Mischung dar, während schwarze gestrichelte Linien die Gesamtpassung darstellen. (C) Zeigerdiagramm der FLIM-Daten für Gerüste, die mit verschiedenen Konzentrationen von Natriumhypochlorit behandelt wurden. Blaue und rote Kreise geben die fluoreszenzgemittelten Zerfallslebensdauern τ1 und τ2 der Kontroll-DBP-G-Probe und des mit 1,5 μmol (NaOCl)/mg (Gerüst) behandelten DBP-G an, geschätzt unter Verwendung eines biexponentiellen Zerfallsmodells, gemittelt über alle Proben und alle Pixel. Fluoreszenz wurde bei 800 nm angeregt und im Bereich von 350–680 nm nachgewiesen. Maßstabsbalken in Panel (A) entsprechen 150 µm.

Die Fluoreszenzlebensdauer τm in den mit 0,1, 0,25 und 0,75 µmol NaOCl/mg Gerüst behandelten Proben wies eine ausgeprägte bimodale Verteilung auf, die wahrscheinlich den Signalen der oxidativ modifizierten und nicht modifizierten Bereiche des Biomaterials entsprach. Diese Bimodalität wird auch in mehreren FLIM-Bildern von Gerüsten beobachtet, die mit mittleren Konzentrationen an hypochloriger Säure verarbeitet wurden. Insbesondere für das FLIM-Bild eines mit 0,75 µmol NaOCl/mg Gerüst behandelten DBP-G-Gerüsts (Abb. 1A) haben wir darauf hingewiesen, dass FLIM Regionen von DBP-G-Gerüsten mit homogener und heterogener Fluoreszenzlebensdauerverteilung beobachtete. Weitere Beispiele für τm-Karten für DBP-G-Gerüste, die mit 0,1, 0,25 und 0,75 µmol (NaOCl)/mg (DBP-G) behandelt wurden, mit visuell homogener und heterogener Verteilung sind in Abb. S2 dargestellt. Um die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer dieser Regionen zu quantifizieren, wurden die Verteilungen der Fluoreszenzlebensdauer τm für die Proben mithilfe eines Zweikomponenten-Gaußschen Mischungsmodells angepasst. Die Fluoreszenzlebensdauer des Clusters, die modifizierten Bereichen zugeschrieben wird, die längere Lebensdauern aufwiesen (rote gestrichelte Kurven in Abb. 1B), reagierte empfindlicher auf die NaOCl-Behandlung und ihre Position änderte sich von ~760 ps für 0,1 (NaOCl)/mg (Gerüst). ) bis zu 850 bzw. 980 ps für Proben, die mit 0,25 bzw. 0,75 µmol NaOCl/mg Gerüst behandelt wurden. Die Positionen der Cluster mit kürzerer Lebensdauer verschoben sich leicht und betrugen ~ 650, 680 und 740 ps für die Proben, die mit 0,1, 0,25 bzw. 0,75 µmol NaOCl/mg Gerüst behandelt wurden. Die bimodale Anpassung ermöglichte es uns auch, den Anteil des oxidierten Materials in Proben zu bewerten, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumhypochlorit behandelt wurden, indem wir den Anteil der Pixel berechneten, die dem Cluster mit einer längeren Lebensdauer zugeordnet wurden, die mit zunehmender Hypochloritkonzentration allmählich zunahm. Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Nach der Behandlung mit 1,5 µmol NaOCl/mg Gerüst hatte die durchschnittliche Fluoreszenzabklingzeit ein Maximum bei ~ 1350 ps und ihre Verteilung war monomodal, was wahrscheinlich darauf hinweist, dass der Großteil der Probe einer oxidativen Modifikation unterzogen wurde.

Um die beobachteten Unterschiede besser zu charakterisieren, haben wir die FLIM-Daten mithilfe der Zeigerdiagramme (Abb. 1C) visualisiert, in denen jeder Punkt Fluoreszenzabklingkurven mit einer bestimmten Fluoreszenzabklingzeit darstellt und Änderungen sowohl bei der Fluoreszenzabklinglebensdauer als auch bei den Amplitudenverhältnissen leicht erkennbar sind . Beim monoexponentiellen Zerfall liegt der entsprechende Punkt auf dem Universalkreis, beim multiexponentiellen Zerfall liegt der Punkt innerhalb des Universalkreises30. Wir haben beobachtet, dass sich die Verteilung sowohl der s- als auch der g-Phasorkomponenten in Richtung längerer Fluoreszenzzerfallslebensdauern verschiebt, was sowohl durch Änderungen der Fluoreszenzlebensdauerwerte (hauptsächlich längere Fluoreszenzlebensdauer τ2) als auch durch das Verhältnis zwischen den Werten der schnellen und langsamen Fluoreszenzzerfallskomponenten a1 verursacht wird /a2. Verteilungen der Fluoreszenzabklingkomponenten (Amplitude der kurzen Komponente a1 und Fluoreszenzlebensdauern τ1 und τ2), die mithilfe der nichtlinearen Anpassung der kleinsten Quadrate erhalten wurden, sind ebenfalls in den Zusatzinformationen dargestellt (Abb. S3).

Bei der Gerüstimplantation stimuliert eine unmittelbare Reaktion beschädigter Zellen und Gewebe die Migration von Neutrophilen zur Verletzungsstelle und deren Aktivierung8. Es gibt mehrere wichtige Merkmale der Wechselwirkungen zwischen den beschädigten Zellen und Neutrophilen: (i) beschädigte Zellen geben „Alarmsignale“ ab; (ii) an ein Material gebundene Plasmaproteine lösen verschiedene Immunsignalkaskaden aus, um Entzündungen zu fördern; (iii) aktivierte Blutplättchen sind an den Reaktionen der angeborenen Immunität beteiligt. Da diese Bedingungen in In-vitro-Experimenten nicht leicht zu reproduzieren sind, haben wir Neutrophile durch PMA aktiviert, was die Sekretion von MPO36 stimuliert und die Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen (NETs) induziert (in Gegenwart reaktiver Sauerstoffspezies)37. In Gegenwart von Wasserstoffperoxid synthetisiert MPO HOCl. In unseren Experimenten inkubierten wir DBP-G mit Neutrophilen für 15–17 Stunden (wobei wir viermal eine neue Suspension von Neutrophilen hinzufügten). PMA wurde 15 Minuten nach Beginn jeder Inkubation zugegeben, 100 µM H2O2 wurden in 1,5 Stunden dreimal im Abstand von 30 Minuten zugegeben (siehe Protokoll in Abschnitt „Neutrophile Isolierung und Inkubation mit Gerüst“).

Da MPT-FLIM in Modellversuchen empfindlich auf den Abbau von Gerüsten reagierte, untersuchten wir die Veränderungen der Fluoreszenzreaktionen in DBP-G-Gerüsten, die durch die Exposition gegenüber den Zellen des Immunsystems – Neutrophile – verursacht wurden. Die repräsentativen Karten der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer der Kontroll- und DBP-G-Proben, die aktivierten Neutrophilen ausgesetzt waren, sind in den Abbildungen dargestellt. 2A,B. Die Oberfläche des behandelten Gerüsts war morphologisch heterogener als die Oberfläche der Kontrollprobe. Die mit Neutrophilen behandelten Proben zeigten auch die heterogene Verteilung der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer über die Probe, die im Vergleich zur Kontrollprobe zu längeren Lebensdauern verschoben war (Abb. 2A, B). Der Medianwert der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer verschob sich von 600 auf 650 ps (p < 10–4), was auf eine Modifikation der Gerüstoberfläche in Gegenwart der Immunzellen hinweist (Abb. 2C).

Fluoreszenzzerfallsparameter von DBP-G-Gerüsten, die mit Neutrophilen inkubiert wurden. (A,B) Karten der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer (τm) des Kontroll-DPB-G-Gerüsts (A) und des DPB-G-Gerüsts, inkubiert mit Neutrophilen, die zusätzlich mit PMA aktiviert wurden (B). (C) Histogrammverteilungen der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer τm für Kontroll- und behandelte DPB-G-Proben. Fluoreszenz wurde bei 800 nm angeregt und im Bereich von 350–680 nm nachgewiesen. Maßstabsbalken in den Panels (A) und (B) entsprechen 150 µm.

Während vernetztes DPB-G eine helle Genipin-assoziierte Fluoreszenz zeigt, zeigen viele andere Vernetzungen keine starke Absorption und Fluoreszenz im sichtbaren Bereich. Daher untersuchten wir weiter die Möglichkeit, den Abbau von DPB-Gerüsten mit einem Vernetzer zu bewerten, der nicht die Bildung heller fluoreszierender Vernetzungen induziert. Wir haben versucht, FLIM-Messungen mit Biogerüsten durchzuführen, die mit dem nicht fluoreszierenden Wirkstoff vernetzt sind – DBP-Gerüste, vernetzt mit Ethylenglykoldiglycidylether (DBP-EGDE), der im sichtbaren Bereich weder absorbiert noch fluoresziert. Die Autofluoreszenz kann in diesem Fall von den heterogenen Oxidationsprodukten der molekularen Bestandteile des Gerüsts (z. B. Proteine) herrühren, die eine geringe Fluoreszenzausbeute aufweisen, aber im sichtbaren und sogar im nahen Infrarot-Spektralbereich angeregt werden können38. Die DBP-EGDE-Proben wurden mit Natriumhypochlorit behandelt. In Wasser hydrolysiert NaOCl zu hypochloriger Säure – einem der wichtigsten Oxidationsmittel, die von aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden.

Die Intensität der Fluoreszenzreaktion der Oxidationsprodukte von Proteinen könnte bei effektiverer Anregung im kurzwelligen Bereich relativ gering sein (Quantenausbeute ~0,1–1 %). Wir beobachteten, dass die Fluoreszenzintensität der bei 800 nm angeregten DBP-EGDE-Gerüste etwa 100-fach niedriger war als die der DBP-G-Gerüste, während die optische Reaktion von DBP-EGDE auch einen starken Signalbeitrag der zweiten Harmonischen zur optischen Reaktion aufwies, was behindert die Fluoreszenzlebensdaueranalyse (siehe Details zur Fluoreszenzintensitätsbewertung und zum Signalbeitrag der zweiten Harmonischen in den Ergänzenden Anmerkungen 1, 2). Daher wurde das Fluoreszenzsignal bei 730 nm angeregt und im Bereich von 350–680 nm detektiert. Die Fluoreszenzintensität der DBP-EGDE-Gerüste war etwa 100-fach niedriger als die der DBP-G-Gerüste. Dennoch wurde eine deutliche Autofluoreszenz der Kontroll- und behandelten DPB-EGDE-Gerüste beobachtet und mithilfe des biexponentiellen Zerfallsmodells angepasst (Abb. 3).

Fluoreszenzzerfallsparameter der dezellularisierten Rinder-Perikardgerüste, vernetzt mit Ethylenglykoldiglycidilether und behandelt mit Natriumhypochlorit, modellieren die Immunantwort auf das Biomaterial. (A, B) Karten der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer (τm) des Kontroll-DPB-EGDE-Gerüsts (A) und des DPB-EGDE-Gerüsts, behandelt mit 1,5 µmol (NaOCl)/mg (Gerüst) (B). (C) Histogrammverteilungen der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer τm für DPB-EGDE-Proben, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumhypochlorit behandelt wurden. Die Fluoreszenz wurde bei 730 nm angeregt und im Bereich von 350–680 nm nachgewiesen. Maßstabsbalken in den Panels (A) und (B) entsprechen 150 µm.

Die Karten der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer τm für die Kontroll- und behandelten DBP-EGDE-Gerüste sind in Abb. 3A, B dargestellt. Die Morphologie dieser Gerüste unterscheidet sich erheblich von der von DPB-G: Es wurden nämlich deutlich einzelne Gerüstfasern beobachtet. Zweitens war die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer in den DBP-EGDE-Gerüsten sowohl in den Kontrollproben als auch in den mit NaOCl behandelten Proben heterogen verteilt. Diese Heterogenität könnte durch die heterogene Natur der Oxidationsprodukte verursacht werden, die vermutlich die Hauptquelle der beobachteten Fluoreszenz sind.

Abbildung 3C zeigt die Verteilungshistogramme der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer τm. Die τm-Werte in der mit Hypochlorit behandelten Probe stiegen im Vergleich zur Kontrollprobe von ~ 1160 ps auf ~ 1360 ps. Daher können in DBP-EGDE-Gerüsten, bei denen die Hauptquelle der Autofluoreszenz höchstwahrscheinlich die Oxidationsprodukte der Gerüstproteine sind, die über MPT-FLIM ermittelten Fluoreszenzzerfallsparameter verwendet werden, um den durch Oxidation verursachten Abbau des Gerüsts zu bewerten.

Zusätzlich wurde eine unabhängige nicht-optische Methode verwendet, um die Modifikation des Gerüsts durch NaOCl zu dokumentieren. Wir verwendeten AFM zur Charakterisierung der Änderungen der mikromechanischen Eigenschaften von mit NaOCl behandelten DPB-G-Proben. Die Kontrollproben waren hinsichtlich des Elastizitätsmoduls recht heterogen mit typischen Werten im Bereich von 5–20 MPa (Abb. 4A, B). Nach der Behandlung mit NaOCl beobachteten wir eine Abnahme des Young-Moduls der behandelten DPB-G-Proben im Vergleich zu den Kontrollproben. Diese Abnahme war proportional zur verwendeten NaOCl-Konzentration (Abb. 4C, D). Die geringste Abnahme (2,7-fach) wurde bei 0,25 µmol (NaOCl)/mg (Gerüst) festgestellt, die stärkste Abnahme (5,5-fach) bei 1,5 µmol (NaOCl)/mg (Gerüst). Das „Erweichen“ behandelter DPB-G-Proben kann mit dem Abbau einzelner Gerüstfasern und der Vernetzung zwischen ihnen zusammenhängen. Es gab jedoch keine klaren Unterschiede zwischen den topografischen Bildern der Kontrollproben und der behandelten Proben, die alle recht heterogen waren und sowohl fibrilläre (Abb. 4A) als auch amorphe Bereiche (Abb. 4B) enthielten. Wir fanden auch heraus, dass die Änderungen der mechanischen Eigenschaften mit der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer τm für dieselben Proben korrelierten, was zeigt, dass die Parameter des Fluoreszenzabfalls als Indikatoren für die Änderungen der mechanischen Eigenschaften verwendet werden können (Abb. 4D).

Repräsentative AFM-Daten von dezellularisierten Rinder-Perikardgerüsten, vernetzt mit Genipin (DBP-G), behandelt mit Natriumhypochlorit. (A–B) Topographiebilder des Kontroll-DPB-G-Gerüsts und der DPB-G-Gerüste, behandelt mit 0,25, 0,75, 1,5 µmol (NaOCl)/mg (Gerüst): fibrilläre Bereiche (A) und amorphe Bereiche (B). (C) Nanomechanische Karten (Verteilung des Young-Moduls, E) der Kontroll- und behandelten DBP-G-Proben. Alle Bilder haben die gleiche farbcodierte Skala für den Modul; der Maßstabsbalken beträgt 2 µm. (D) Young-Modul der Kontroll-DPB-G-Probe und DBP-G-Proben, behandelt mit 0,25, 0,75 und 1,5 µmol (NaOCl)/mg (Gerüst) (linkes Feld) und Anstieg der Fluoreszenzlebensdauer \(\tau_{m }\) für die gleichen Proben (rechtes Feld). Die Daten in Panel (D) werden in Form eines Superplots dargestellt: Kleine Punkte stellen den durchschnittlichen Young-Modul und die Fluoreszenzlebensdauer τm dar, gemittelt über das eine Bild, während große Punkte den Durchschnitt über die wiederholten Experimente darstellen. Horizontale Linien stellen den Gesamtdurchschnitt für behandelte und unbehandelte DBP-G-Gerüste dar.

Eine genaue und schnelle Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der künstlich hergestellten und natürlichen Gewebe ist für die moderne regenerative Medizin von größter Bedeutung. Optische Techniken, insbesondere MPT-FLIM, bieten die Möglichkeit, den Zustand von Zellen und Geweben mit einer subzellulären Auflösung zu beurteilen, indem sie die Parameter der Fluoreszenz-Abklingkurven abbilden. Die Fluoreszenzabklingparameter der endogenen Fluorophore, wie NAD(P)H und FAD, ermöglichen die Beurteilung des Stoffwechselstatus von Zellen und Geweben17, die gleichzeitige Verwendung der Zellmorphologie und ihrer Fluoreszenzabklingparameter ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen Arten von Fluorophoren Zellen sowohl in vitro als auch in vivo mit FLIM39,40. Der Einsatz der Multiphotonenanregung im Nahinfrarotbereich ermöglicht das Scannen relativ tiefer Gewebeschichten und damit die Lokalisierung und Charakterisierung von Strukturproteinen, die Bestimmung der Parameter der Mikrokapillaren und die Untersuchung physiologischer Prozesse in vivo27,41. FLIM wurde auch bei der Bewertung der Eigenschaften der technischen Biomaterialien verwendet18,19,20,21,22,23. In dieser Arbeit haben wir FLIM angewendet, um die Modifikation von Kollagengerüsten in Modellsystemen zu bewerten, die die proinflammatorische Reaktion der Immunzellen nachahmen.

Gewebeschäden und die Implantation von Fremdmaterial lösen eine akute Entzündungsreaktion aus. Die wichtigsten Immunzellen, die zur Implantationsstelle rekrutiert werden, sind Phagozyten-Neutrophile und Makrophagen im proinflammatorischen M1-Zustand. Die Infiltration von Gerüsten durch Neutrophile erfolgt in der ersten Woche nach der Implantation von Materialien in Versuchstiere42,43. Das Auftreten von Neutrophilen und deren Ersatz durch Makrophagen im Zusammenhang mit dem Gerüstabbau sind für eine Reihe von Materialien, einschließlich vernetzter Bionetze auf Kollagenbasis, gut dokumentiert21,44. Allerdings ist die oxidative Veränderung von Materialien durch aktivierte Phagozyten nicht ausreichend untersucht.

Aktivierte Phagozyten erzeugen ROS-Hydroxyl- und Hydroperoxylradikale (HO· und HOO·), Peroxynitrit (ONOO-) und hypochlorige Säure (HOCl ↔ H+ + OCl−), um bakterielle und virale Krankheitserreger sowie andere fremde Eindringlinge an der Stelle zu bekämpfen von Schäden. HOCl ist ein starkes Oxidationsmittel, das von der neutrophilen Myeloperoxidase in Gegenwart von H2O2 und Cl- produziert wird. HOCl ist offenbar wirksamer bei der Oxidation und dem Abbau kohlenstoffhaltiger Nanomaterialien wie Kohlenstoffnanoröhren und Graphenoxid als andere ROS-Spezies12,45,46.

Wir stellten die Hypothese auf, dass ein starkes Oxidationsmittel HOCl (Redoxpotential des Paares HOCl/Cl−, H2O beträgt ~1,3 V10) Biomaterialien, einschließlich mit Genipin und Ethylenglykoldiglycidylether vernetzter Perikardgerüste, oxidativ modifizieren und biologisch abbauen kann. An der Entzündungsstelle produzieren in vivo aktivierte Neutrophile kontinuierlich HOCl, und neue Zellen ersetzen apoptotische Neutrophile. In unseren In-vitro-Experimenten haben wir wiederholt ein neues Aliquot NaOCl hinzugefügt. Die Anzahl der Zugaben und die Menge an zugesetztem NaOCl hing vom Gewicht des Gerüsts und von der gewünschten Reagenzkonzentration ab. Die in unseren Experimenten verwendeten NaOCl-Konzentrationen waren mit den erwarteten Mengen bei akuten Entzündungen vergleichbar. Die lokalen Gleichgewichtskonzentrationen von HOCl an der Entzündungsstelle können 100 μM überschreiten, was eine effiziente Oxidation von Fremdmaterial gewährleistet47. In unseren Experimenten wurde die Konzentration von 0,1 µmol NaOCl pro mg Perikard durch eine einzige Zugabe von 300 µM NaOCl erreicht, wohingegen die Konzentration von 0,25 µmol NaOCl pro mg Gerüst durch zwei Zugaben erreicht wurde: 450 µM und 300 µM NaOCl wurden im Abstand von 15 Stunden zugegeben.

Die Fluoreszenzlebensdauer einer großen Anzahl von Fluorophoren hängt vom pH-Wert der Umgebung des Fluorophors ab. Die beobachteten Veränderungen in der Fluoreszenzlebensdauer könnten mit den in den Zellen und Geweben ablaufenden biochemischen Prozessen und/oder mit Veränderungen in den Eigenschaften einzelner Fluorophore zusammenhängen. Beispielsweise wurde festgestellt, dass die endogene Fluoreszenz von NADH in Zellen pH-empfindlich war48. Auf dieser Grundlage kann der pH-Wert in einer einzelnen Zelle durch Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung von NADH bestimmt werden. Bemerkenswert ist, dass das Ausmaß der pH-induzierten Änderungen in den Kernen größer war als in anderen intrazellulären Bereichen (die ∆τm-Abnahme betrug 200 ps, wenn ∆pH ~ 1,0 im pH-Bereich von 5,0 bis 10,0). Das Design und die Synthese von pH-empfindlichen Fluorophoren für die NIR-Fluoreszenzlebensdauer für intrazelluläre und extrazelluläre pH-Messungen wurden in einer Reihe von Studien beschrieben49,50. Der genetisch kodierte pH-Sensor zeigte die höchste Empfindlichkeit im pH-Bereich von 7,5 bis 8,0, wenn der Anstieg der Fluoreszenzlebensdauer etwa 450 ps50 betrug. pH-empfindliche Fluoreszenzlebensdauersonden wurden entwickelt, um das Potenzial von FLIM zu demonstrieren, den Säuregehalt einer Region in vivo schnell zu bestimmen51. Angesichts der pH-Empfindlichkeit von FLIM haben wir den pH-Wert unserer Proben überwacht, da die NaOCl-Stammlösung stark basisch ist. DBP-Proben wurden in (50 mM NaH2PO4 in PBS, pH 7,3–7,4) gegeben. Nach allen Zugaben zur Probe (1,5 µmol NaOCl pro mg DBP-G) überschritt die pH-Verschiebung 0,15 Einheiten nicht und es wurde ein Ausbleichen des Materials beobachtet. Bemerkenswert ist, dass die pH-Änderungen schnell nach der Zugabe eines Mikroaliquots NaOH zur Lösung und dem Vortexen auftreten, während das Bleichen der behandelten Proben und die anschließenden chemischen/biochemischen Veränderungen über einen längeren Zeitraum von wenigen Tagen auftraten (Abb. S4). .

Wir verwendeten FLIM, um die oxidative Modifikation des Perikardgerüsts zu untersuchen, und stellten fest, dass Änderungen der FLIM-Reaktionen sehr empfindlich auf Modifikationen des mit Genipin vernetzten Gerüsts bei der Behandlung mit NaOCl reagierten. Die Lebensdauer der Kontrollproben, die keinem Oxidationsmittel ausgesetzt waren, war am kürzesten (τm ~600 ps) und war unimodal verteilt (Abb. 1B). NaOCl verursachte eine Verlängerung der Fluoreszenzlebensdauer und Veränderungen in der Lebensdauerverteilung. Bei relativ niedrigen biologisch relevanten Konzentrationen von NaOCl (0,1 und 0,25 µmol pro mg Gerüst) wurde eine bimodale Verteilung der Fluoreszenzlebensdauer beobachtet. Diese Bimodalität könnte auf einen Rückgang des Anteils an nativem Material und das Auftreten von oxidiertem DBP-G zurückzuführen sein. Wir gingen davon aus, dass der Cluster mit einer kürzeren Fluoreszenzlebensdauer (blaue Linien in Abb. 1B) der Überlagerung des nativen und leicht oxidierten Gerüsts entsprach, während die Cluster mit einer längeren Lebensdauer (rote Linien) dem Material mit einer höheren Fluoreszenzlebensdauer zugeordnet werden konnten Oxidationsgrad. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, die DBP-G-Oxidation mit Hypochlorit zu erhalten und quantitativ zu charakterisieren (Tabelle 1). Mit der Erhöhung der Menge des zugesetzten Oxidationsmittels (0,1 < 0,25 < 0,75 µmol NaOCl/mg Gerüst) verschoben sich die Maxima beider τm-Verteilungskurven dosisabhängig zu höheren Werten von τm, und gleichzeitig nahm der Beitrag des zu Höher oxidierte Form des Materials erhöht die gesamte Fluoreszenzlebensdauer. Bei 1,5 µmol NaOCl/mg Gerüst war vollständig oxidiertes DBP-G erneut durch eine monomodale τm-Verteilung gekennzeichnet, wobei das Maximum jedoch bei 1,35 ns lag. Die nicht-Gaußsche Form der Verteilung kann für die Materialschädigung bei starker Oxidation verantwortlich sein.

Die beobachtete Änderung der Fluoreszenzlebensdauer ging mit Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der Gerüste einher, wie durch AFM gezeigt, Abb. 4. Bei einer NaOCl-Konzentration von 0,25 µmol pro mg Gerüst verringerte sich der Young-Modul des DBP-G fast um das Dreifache. Eine weitere Erhöhung der Hypochloritkonzentration führte zu keinen wesentlichen Veränderungen der elastischen Eigenschaften der Perikardoberfläche. Es kann davon ausgegangen werden, dass geringe Konzentrationen an Hypochlorit (ca. 0,25 μmol pro mg) ausreichen, um alle Oberflächengruppen des Gerüsts zu modifizieren, die zur Oxidation neigen. Eine weitere Erhöhung der NaOCl-Konzentration führt zur Modifikation tieferer Schichten des Materials, was von FLIM getestet wurde, sowohl durch NaOCl als auch durch langlebige radikalische Zwischenprodukte, die aufgrund der Proteinoxidation entstehen. Wir stellen fest, dass in früheren Arbeiten für DBP auch eine Korrelation des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses und der durchschnittlichen Fluoreszenzlebensdauer mit dem makroskopischen Young-Modul, gemessen durch Zugversuche, beobachtet wurde20.

Wir haben auch versucht, die durch Natriumhypochlorit induzierte oxidative Modifikation der mit EGDE vernetzten Gerüste zu bewerten. Die Intensität des Fluoreszenzsignals war in diesem Fall im Vergleich zu der der DPB-G-Gerüste deutlich geringer, was wahrscheinlich auf die sehr geringen Quantenausbeuten der Oxidationsprodukte zurückzuführen ist38. Die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer war bei Kontrollproben höher als bei Genipin (600 ps vs. 1,16 ns), und bei Hypochloritbehandlung wurde nur ein leichter Anstieg des τm beobachtet.

Neutrophiles MPO ist das einzige Enzym, das in der Lage ist, physiologisch signifikante Mengen an HOCl zu erzeugen. Während der Neutrophilenaktivierung an der Stelle der Gewebeschädigung geben die Neutrophilenkörnchen ihren Inhalt in die Phagosomen und den extrazellulären Raum ab, einschließlich MPO und Verdauungsproteinen wie Kollagenase und Gelatinase. Sperrige Enzyme können nicht in ein Gerüst eindringen, daher ist der Abbau durch Verdauungsenzyme ein Oberflächenerosionsprozess52. Nach unserem Kenntnisstand wurde der MPO-induzierte oxidative Abbau von Biomaterialien in früheren Studien nicht berücksichtigt. Dennoch können durch MPO erzeugte freie Radikale und Oxidationsmittel in die Oberflächenschicht des Materials eindringen und einen oberflächennahen Abbau auslösen.

MPO macht etwa 5 % der Trockenmasse des Neutrophilen aus und wird bis zu einer Konzentration von etwa 1 mM in das Phagosom freigesetzt53,54. Darüber hinaus ist MPO eine der Schlüsselkomponenten des „klebrigen Netzwerks“ – der extrazellulären Neutrophilenfallen55. An der entzündlichen Stelle in unmittelbarer Nähe der Materialoberfläche ist mit einer sehr hohen MPO-Konzentration zu rechnen. Gleichzeitig wird NADPH-Oxidase auf der Plasmamembran aufgebaut und erzeugt Superoxidradikale, die unter Bildung von H2O256 dismutieren. In entzündetem Gewebe können die Steady-State-Konzentrationen von Wasserstoffperoxid im extrazellulären Medium bis zu 100 µM betragen57. Wasserstoffperoxid speist den MPO-Katalysezyklus und ermöglicht es dem Enzym, Chloridionen zu oxidieren und HOCl zu erzeugen (Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung beträgt 2,5 × 104 M−1 s−1 53). HOCl ist ein starkes Oxidationsmittel, das nicht nur Fremdmaterialien, sondern auch Neutrophile selbst unspezifisch angreift und so deren apoptotischen Tod verursacht. Während der akuten Entzündungsreaktion stellt der Ersatz apoptotischer Neutrophiler durch neue sicher, dass aktivierte Neutrophile in der Nähe des Gerüsts für 5–7 Tage vorhanden sind. Dieses langfristige Vorhandensein aktivierter Neutrophiler und NETs im Gerüstbereich führt zu einer massiven Produktion von HOCl durch MPO. Der in vivo MPO-abhängige Abbau hochresistenter Strukturen wie Kohlenstoffnanoröhren wurde dokumentiert58.

In einer separaten Studie haben wir gezeigt, dass DBP-G-Gerüste Neutrophile im Vollblut aktivieren und die Bildung von ROS, die Sekretion von MPO und die Bildung von NETs verursachen (unveröffentlichte Ergebnisse).

Als letzten Schritt wurden Modifikationen von Gerüsten direkt durch Inkubation mit aktivierten Neutrophilen bewertet. In unseren Experimenten erneuerten wir die dem Gerüst hinzugefügte Neutrophilensuspension viermal, um eine längere Koinkubation der Gerüste mit aktivierten Zellen sicherzustellen (die gesamte Inkubationszeit betrug 15–17 Stunden). In Zeiträumen von 60–90 Minuten nach Beginn jeder Inkubation, als die PMA-aktivierten Zellen abstarben49, fügten wir H2O2 (100 µM × 3-mal) hinzu, um MPO mit einer Quelle für Oxidationsäquivalente zu versorgen, die für die HOCl-Synthese benötigt werden. Wir fanden heraus, dass für DBP-G-Gerüste, die mit aktivierten Zellen inkubiert wurden, ein kleiner, aber statistisch signifikanter Anstieg des Medianwerts der durchschnittlichen Fluoreszenzabklingzeit τm von 600 ps für die Kontrollprobe auf ~ 650 ps für die behandelte Probe beobachtet wurde. Die Fluoreszenzabklingzeit τm in der mit Neutrophilen inkubierten Gerüstprobe war ebenfalls heterogener über die Probe verteilt, was die fibrillären Regionen mit der erhöhten Fluoreszenzlebensdauer τm zeigt (Abb. 2B). Im Vergleich zu den Ergebnissen für Experimente mit NaOCl-induzierter Oxidation liegen die Ergebnisse für Experimente mit mit Neutrophilen inkubierten Gerüsten nahe an den Effekten, die für die Konzentration von 0,1 μmol (NaOCl)/mg (Gerüst) beobachtet wurden, wobei ein Medianwert von Die Abklingzeit der Fluoreszenz betrug ~680 ps.

In unseren Experimenten betrug die gesamte Inkubationszeit von DBP-G mit aktivierten Neutrophilen 15–17 Stunden, wohingegen implantierte Materialien mehrere Tage lang Neutrophilen ausgesetzt waren. Nach der subkutanen Implantation von Poly[(L-lactid)-co(ε-caprolacton)]-Gerüsten bei Tieren wurde das injizierte Material eine Woche lang nach der Operation mit Neutrophilen infiltriert42. Aufgrund der hohen HOCl-Konzentration im Steady-State (ca. 100 µM47) an der Entzündungsstelle ist mit einer erheblichen Gerüstmodifikation zu rechnen. Unter Verwendung der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie mit abgeschwächter Gesamtreflexion haben Sutherland et al. haben gezeigt, dass der In-vivo-Abbau von Polyetherurethan-Elastomeren sowohl unterchlorige Säure als auch Oxidationsmittel auf Stickoxidbasis umfassen kann59. Interessanterweise scheinen HOCl und Peroxinitrit Polyetherurethan an unterschiedlichen Stellen anzugreifen. Unsere Studie zeigt, dass FLIM ein nützliches Instrument zur Bewertung extrazellulärer Matrixmodifikationen durch oxidativen Stress ist, der durch Immunzellen erzeugt wird.

Eine frühzeitig nach der Implantation erfolgende Modifikation von Tissue-Engineering-Konstrukten ist unerlässlich, da sie die Immunantwort und die Wundheilung beeinflusst. Hier haben wir gezeigt, dass oxidative Modifikationen der Gerüste auf Kollagenbasis (dezellularisiertes Perikard) durch hypochlorige Säure mit MPT-FLIM quantitativ charakterisiert werden können. Wir haben gezeigt, dass die Oxidationsprozesse mithilfe der Änderungen der Fluoreszenzlebensdauer entweder fluoreszierender Vernetzungen (z. B. Genipin) oder durch Änderungen der Fluoreszenzreaktion von Kollagenoxidationsprodukten quantifiziert werden können. In Experimenten mit DBP-G-Oxidation durch Natriumhypochlorit korrelierten Änderungen in der Modalität der Fluoreszenzlebensdauerverteilung mit unterschiedlichen Oxidationsgraden und Änderungen in den durch AFM bewerteten mechanischen Eigenschaften. Wir haben auch gezeigt, dass eine weniger intensive Fluoreszenz, die von den Oxidationsprodukten des Gerüstkollagens herrührt, ebenfalls mit FLIM beurteilt werden kann. Wir kommen zu dem Schluss, dass das FLIM-Protokoll für eine schnelle quantitative, markierungsfreie Bewertung der Eigenschaften von Biomaterialien verwendet werden kann.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Prof. Istranov LP und Dr. Istranova EV für die freundlicherweise zur Verfügung gestellten Proben von Perikardgerüsten (Institut für Regenerative Medizin, Sechenov-Universität). Diese Forschungsarbeit wurde durch das akademische Führungsprogramm Priority 2030 unterstützt, das von der Föderalen Autonomen Bildungseinrichtung für höhere Bildung IM Sechenov, der Ersten Moskauer Staatlichen Medizinischen Universität des Gesundheitsministeriums der Russischen Föderation (Sechenov-Universität), vorgeschlagen wurde. Diese Forschung wurde mithilfe der einzigartigen wissenschaftlichen Einrichtung Transgenebank (Institut für Genbiologie RAS) und gemäß dem Entwicklungsprogramm der interdisziplinären Wissenschafts- und Bildungsschulen der Lomonossow-Universität Moskau „Photonische und Quantentechnologien“ durchgeführt. Digitale Medizin“ und „Molekulare Technologien lebender Systeme und Synthetische Biologie“.

Diese Arbeit wurde von der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung, Projekt Nr. 20-015-00480 (Experimente zum Abbau von Gerüsten und FLIM) und von der Russischen Wissenschaftsstiftung, Projekt Nr. 18-15-00401 (Herstellung und Analyse von Perikardgerüsten), unterstützt.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: BP Yakimov und II Vlasova.

Weltklasse-Forschungszentrum „Digitales Biodesign und personalisierte Gesundheitsversorgung“, Erste Moskauer Staatliche Medizinische Universität Sechenov, Trubetskaya 8, Moskau, Russland, 119048

Yakimov BP, Vlasova II, Efremov YM, Shirshin EA und Timashev PS

Fakultät für Physik, MV Lomonossow-Universität Moskau, 1-2 Leninskie Gory, Moskau, Russland, 119991

BP Yakimov & EA Shirshin

Abteilung für fortgeschrittene Biomaterialien, Institut für Regenerative Medizin, Erste Moskauer Staatliche Medizinische Universität Sechenov, Trubetskaya 8, Moskau, Russland, 119048

II Vlasova, YM Efremov, VE Kagan & PS Timashev

Fakultät für Biologie, MV Lomonossow-Universität Moskau, 1-12 Leninskie Gory, Moskau, Russland, 119991

EG Maksimov

Center for Free Radical and Antioxidant Health, Department of Environmental and Occupational Health, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, 15261, USA

VE Kagan

Fakultät für Chemie, MV Lomonossow-Universität Moskau, 1-3 Leninskie Gory, Moskau, Russland, 119991

PS Timaschew

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YBP – Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf, VII – Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurf; EYM – Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf; MEG – Validierung, Ressourcen, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten; SEA – Konzeptualisierung, Methodik, Projektverwaltung, Schreiben – Originalentwurf; KVE und TPS – Konzeptualisierung, Supervision, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten.

Korrespondenz mit EA Shirshin oder PS Timashev.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yakimov, BP, Vlasova, II, Efremov, YM et al. Nachweis des HOCl-bedingten Abbaus der Perikardgerüste durch markierungsfreie Multiphotonen-Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung. Sci Rep 12, 10329 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14138-5

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Eingegangen: 02. November 2021

Angenommen: 17. Mai 2022

Veröffentlicht: 20. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14138-5

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